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Jun 16, 2023

DprE2 ist ein molekulares Ziel des Anti

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 3828 (2023) Diesen Artikel zitieren 1868 Zugriffe 13 Altmetric Metrics-Details Mycobacterium tuberculosis ist eine der weltweit häufigsten Todesursachen aufgrund von

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 3828 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mycobacterium tuberculosis ist eine der weltweit häufigsten Todesursachen aufgrund eines einzelnen Infektionserregers. Pretomanid und Delamanid sind neue Antituberkulosewirkstoffe, die in der Arzneimittelforschung Fortschritte gemacht haben. Bei diesen Verbindungen handelt es sich um bizyklische Nitroimidazole, die als Prodrugs wirken und eine Aktivierung durch ein mykobakterielles Enzym erfordern; Allerdings sind die genauen Wirkmechanismen des/der aktiven Metaboliten unklar. Hier identifizieren wir ein molekulares Ziel von aktiviertem Pretomanid und Delamanid: die DprE2-Untereinheit der Decaprenylphosphoribose-2'-Epimerase, einem Enzym, das für die Synthese von Zellwand-Arabinogalactan erforderlich ist. Wir liefern auch Hinweise auf ein NAD-Addukt als aktiven Metaboliten von Pretomanid. Unsere Ergebnisse heben DprE2 als potenzielles antimykobakterielles Ziel hervor und bieten eine Grundlage für die zukünftige Erforschung der aktiven Metaboliten und die klinische Entwicklung von Pretomanid und Delamanid.

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), der Erreger der Tuberkulose (TB), gilt seit 2014 als häufigste Todesursache durch einen einzelnen Infektionserreger. Obwohl es in jüngerer Zeit durch COVID-19 abgelöst wurde, das sich auch auf die Falldiagnose und -berichterstattung ausgewirkt hat, Im Jahr 2021 entwickelten schätzungsweise 10,6 Millionen Menschen eine aktive Tuberkuloseerkrankung mit 1,6 Millionen damit verbundenen Todesfällen, was ein Beispiel für die weltweite Belastung durch Tuberkulose darstellt1,2. Trotz eines allmählichen Rückgangs der Sterblichkeitsrate in den letzten Jahren gefährden multiresistente (MDR) und extensiv resistente (XDR) Mtb-Stämme weiterhin die Wirksamkeit der aktuellen Behandlungsstrategie und erfordern die dringende Einführung neuer Chemotherapeutika und Medikamentenschemata . Derzeit befinden sich 26 Tuberkulosemedikamente in klinischen Studien und Kombinationsprogrammen der Phasen I, II und III, um eine wirksame Behandlung von arzneimittelanfälligen, MDR- und latenten Formen der Tuberkulose zu erreichen. Diese Medikamente bestehen aus 17 neuen Verbindungen, 6 zweckentfremdeten Medikamenten und 3, die eine behördliche Zulassung erhalten haben und bei einer ausgewählten Population von MDR-TB-Patienten2 eingesetzt werden. Zwei dieser zugelassenen Verbindungen sind die bizyklischen 4-Nitroimidazole Pretomanid (PA-824; Global Alliance for TB Drug Discovery) und Delamanid (OPC-67683, Deltyba; Otsuka Pharmaceutical Company) (Abb. 1a), die die klinische Phase III abgeschlossen haben Studien zur Kombinationstherapie mit positiven Ergebnissen3,4. Infolgedessen hat die US-amerikanische Food and Drug Administration die Verwendung von Pretomanid in Kombination mit Linezolid und Bedaquilin zur Behandlung spezifischer Tuberkuloseinfektionen zugelassen5. Zusätzlich zu ihrer starken Aktivität gegen klinische MDR-Isolate sind Pretomanid und Delamanid auch gegen nicht replizierendes TB6,7 aktiv, was ihr therapeutisches Potenzial weiter erweitert.

a Strukturen von Pretomanid und Delamanid. Die gemeinsame Nitrogruppe ist rot hervorgehoben. b Pro-Drug-Aktivierungsmechanismus mit F420-Redox-Cycling. Fgd1 katalysiert die Oxidation von Glucose-6-phosphat zu 6-Phosphogluconolacton und erzeugt F420-H2. Dieses Coenzym wird dann durch Ddn bei der Reduktion der Prodrugs Pretomanid oder Delamanid in aktive Formen oxidiert, wodurch F420 regeneriert wird. DprE1 katalysiert die Oxidation von DPR (Decaprenylphosphoryl-D-Ribose) zu einem Keto-Zwischenprodukt, DPX (Decaprenylphosphoryl-2-ketoribose), das anschließend durch DprE2 reduziert wird, wodurch DPA (Decaprenylphosphoryl-D-Arabinose) entsteht. Die aktivierten Prodrugs hemmen die DprE2-katalysierte Reduktion von DPX. Die R-Gruppe stellt die Decaprenyl-Einheit (C50) dar.

Obwohl Pretomanid und Delamanid seit über einem Jahrzehnt in klinischen Studien eingesetzt werden, sind ihre genauen molekularen Ziele noch immer unklar. Es ist seit langem bekannt, dass sowohl Pretomanid als auch Delamanid Prodrugs sind, die eine Aktivierung durch die Deazaflavin F420-abhängige Nitroreduktase Ddn8 (Abb. 1b) erfordern, die ausschließlich in den Mykobakterienzellen und nicht im Wirt exprimiert wird9. Klinisch und im Labor erzeugte resistente Isolate weisen Mutationen in entweder Ddn oder einem von fünf anderen Genen auf, die alle für die Aktivierung von Arzneimitteln essentiell sind: fbiA, fbiB, fbiC, fbiD oder fgd110,11,12. FbiA, FbiB und FbiC sind an der Synthese von F420 beteiligt und Fgd1 ist eine F420-abhängige Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, die die reduzierte Form des F420-Cofaktors für weitere Zyklen mit Ddn10 regeneriert (Abb. 1b). Mutationen im molekularen Ziel wurden nicht dokumentiert, was Fortschritte bei der Zielvalidierung verhindert hat, die weiterhin erforscht werden.

Die Zielzuweisung ist für den Fortschritt der Bemühungen der medizinischen Chemie zur Verbesserung der Wirksamkeit, Toxizität und des Bioverfügbarkeitspotenzials von Verbindungen für den klinischen Einsatz von großem Wert. Die aktuellen Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Pretomanid und Delamanid über einen vielfältigen Wirkmechanismus verfügen, der von aeroben und anaeroben Bedingungen abhängt, obwohl der/die aktive(n) Metabolit(e) noch bestätigt werden müssen. Während des aeroben Wachstums hat sich gezeigt, dass die Behandlung mit Pretomanid oder Delamanid die Zellwand der Mykobakterien beeinflusst13, wobei eine Verringerung der Mycolat-Zwischenprodukte auf die Mykolsäuresynthese als wahrscheinliches Ziel hindeutet6,7. Während der nicht-replizierenden Phase ist der Umbau der Zellwand begrenzt14, und es wurde vermutet, dass die sauerstofflimitierenden Bedingungen ein größerer Faktor für die beobachtete Atemwegsvergiftung sein könnten, die durch beide Medikamente verursacht wird. Es wird angenommen, dass dies durch die Freisetzung reaktiver Stickstoffspezies (wie Stickoxid (NO) während der Aktivierung des Medikaments) geschieht, die den Elektronenfluss und die ATP-Homöostase beeinträchtigen8,13,15. Jüngste Erkenntnisse deuten jedoch darauf hin, dass das Vorhandensein eines NO-Fängers keinen Einfluss auf die antimykobakterielle Wirkung von Delamanid unter hypoxischen, nicht replizierenden Bedingungen hat, was darauf hindeutet, dass ein alternativer Mechanismus möglich ist9.

Bei der Reduktion durch Ddn werden Pretomanid und Delamanid in viele verschiedene Metaboliten umgewandelt, von denen einige wahrscheinlich instabil und kurzlebig sind8,9. Die Synthese der identifizierten stabileren Metaboliten hat gezeigt, dass keiner gegen Mtb wirksam ist und dass ein instabiles Derivat die aktive Form der Arzneimittel darstellen könnte8. Bemühungen zur Identifizierung des aktiven Metaboliten führten auch zur Entdeckung von NAD-Addukten sowohl in mit Pretomanid als auch mit Delamanid behandeltem Mtb9,16. Die antimykobakterielle Aktivität dieser NAD-Addukte wurde jedoch nicht beobachtet, möglicherweise aufgrund der geringen Membranpermeabilität für In-vitro-Studien9.

In dieser Arbeit haben wir das essentielle Enzym Decaprenylphosphoryl-2-keto-β-D-erythro-pentose-reduktase (DprE2)17, das für die Synthese von Vorläufern der Zellwandkomponente Arabinogalactan erforderlich ist, als molekulares Ziel von Pretomanid und identifiziert Delamanid (Abb. 1). Wir belegen auch die Notwendigkeit von NAD(H) bei der Aktivierung von Pretomanid, was weitere Belege für das NAD-Addukt als aktiven Metaboliten liefert und darauf hindeutet, dass NADH der natürliche Cofaktor von DprE2 ist. Wir gehen davon aus, dass diese Wissenserweiterung zukünftige Optimierungen der medizinischen Chemie und direkte Behandlungskombinationen dieser vielversprechenden Anti-Tuberkulose-Verbindungen unterstützen wird.

In unserem kontinuierlichen Bestreben, neue chemische Gerüste und Wirkstofftargets zu identifizieren, um die Entwicklung von Tuberkulosemedikamenten zu unterstützen, haben wir uns bemüht, Inhibitoren für ungenutzte Targets innerhalb der Zellwandbiosynthese von Mykobakterien zu finden. Die essentielle Decaprenylphosphoribose-2'-Epimerase, bestehend aus den Untereinheiten DprE1 und DprE2, ist für die Synthese des lipidgebundenen D-Arabinose-Donors Decaprenylphosphoryl-D-Arabinose (DPA) (Abb. 1b) verantwortlich, der ein Vorläufer von ist ein Hauptbestandteil der Zellwand, Arabinogalactan18,19,20,21. DprE1 (Decaprenylphosphoryl-β-D-Ribose-Oxidase) ist ein validiertes Wirkstoffziel;22,23 die Benzothiazinon (BTZ)-Verbindungen BTZ043 und PBTZ169, die auf DprE1 abzielen, durchlaufen derzeit klinische Studien24. Aufgrund seiner Medikamentenfähigkeit wurde DprE1 umfassend auf neue Hemmgerüste untersucht. Im Gegenteil, trotz seiner Eignung als Wirkstoffziel wurden Inhibitoren von DprE2 nicht beschrieben. Daher haben wir uns zum Ziel gesetzt, durch die Verwendung eines Ganzzell-Phänotyp-Target-Screenings neue Verbindungsklassen zu identifizieren, die DprE2 spezifisch hemmen. Anhand dieses Screenings identifizierten wir eine Reihe von Verbindungstreffern, die durch Sequenzierung des gesamten Genoms spontan resistenter Mutanten zur Zielvalidierung weitergeführt wurden25. Die Daten zeigten Mutationen in den Genen fgd1 und fbiC, die den Mutationen in Pretomanid- und Delamanid-resistenten Isolaten gemeinsam sind. Daraus gingen wir davon aus, dass die Verbindungen denselben Pro-Drug-Aktivierungsweg haben und daher möglicherweise dasselbe Ziel haben könnten. Daher untersuchten wir, ob Pretomanid und Delamanid tatsächlich auf DprE2 abzielten.

Zunächst wurde der Einfluss auf die minimale Hemmkonzentration (MHK) von Pretomanid und Delamanid anhand von Mycobacterium bovis BCG-Stämmen bestimmt, die Mtb DprE1 (Mt-DprE1) oder Mtb DprE2 (Mt-DprE2) überexprimieren, mit einer leeren Vektorkontrolle (Abb. 2). Die mykobakteriellen Expressionsvektoren pMV261, die Mtb dprE1 oder dprE2 beherbergen, wurden in M. bovis BCG elektroporiert und der Microplate Alamar Blue Assay (MABA) sowie die Zählung koloniebildender Einheiten (CFU) wurden verwendet, um die Lebensfähigkeit der Zellen über einen Bereich von Arzneimittelkonzentrationen zu ermitteln. Die MABA-Ergebnisse zeigen deutlich, dass es bei Überexpression von Mt-DprE2 im Vergleich zur Leervektorkontrolle zu einem mehr als 20-fachen Anstieg der Resistenz sowohl gegen Pretomanid (MHK 0,05 μM bis >1 μM) als auch gegen Delamanid (MHK 0,005) kommt μM bis >0,1 μM). Zwischen der Überexpression von Mt-DprE1 und dem leeren Vektor (MIC Pretomanid, 0,1 μM; Delamanid, 0,005 μM) wurde keine signifikante Änderung der Hemmung beobachtet. Positiv- und Negativkontrollstudien wurden mit BTZ (um speziell auf DprE1 abzuzielen) bzw. Isoniazid durchgeführt. Eine Resistenz gegen BTZ wurde nur beim DprE1-Überexpressionsstamm beobachtet, und weder bei den Mt-DprE1- noch bei den Mt-DprE2-Überexpressionsstämmen wurde eine Zunahme der Resistenz gegen Isoniazid beobachtet. Ein Mtb inhA-Überexpressionsstamm wurde verwendet, um die Spezifität von Pretamonid und Delamanid für die Hemmung von DprE2 und nicht anderer allgegenwärtiger NAD(P)H-abhängiger Enzyme zu zeigen (ergänzende Abbildung 1). Die CFU-Zählung bestätigte die Interpretation der MABA-Ergebnisse.

Die MHKs von a Pretomanid und b Delamanid wurden unter Verwendung von M. bovis BCG-Stämmen ermittelt, die die konstitutiven Expressionsvektoren pMV261 (rot), pMV261-Mt-dprE1 (blau) und pMV261-Mt-dprE2 (grün) enthielten. c BTZ wurde als Positivkontrolle für die DprE1-Hemmung verwendet; d Isoniazid wurde als Negativkontrolle für die DprE1- und DprE2-Hemmung verwendet. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mithilfe der MABA- und CFU-Zählung bestimmt. Pfeile in den MABA-Diagrammen geben die Konzentration des für die CFU-Zählung ausgewählten Arzneimittels an. Die Daten wurden mit Prism GraphPad aufgezeichnet und angepasst und zeigten das prozentuale Überleben (MABA) oder CFU/ml (einzelne Datenpunkte als graue Kreise dargestellt), basierend auf dem Mittelwert dreifacher Daten (n = 3) aus unabhängigen Experimenten, wobei Balken den Standardfehler darstellen . Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die spezifische Hemmung der DPA-Synthese durch aktiviertes Pretomanid zu bestätigen, wurde ein In-vitro-Assay mit Dünnschichtchromatographie (TLC)-Analyse verwendet, um die DprE1-DprE2-abhängige Epimerisierung von [14C]-DPR (Decaprenylphosphoryl-D-Ribose) zu [ 14C]-DPA (Decaprenylphosphoryl-D-Arabinose) (Abb. 1) unter Verwendung rekombinanter Enzyme (entweder Mt-DprE1 oder der Mt-DprE1-DprE2-Komplex). Delamanid wurde aufgrund seiner Unlöslichkeit in den verwendeten Puffern nicht in kinetischen In-vitro-Tests berücksichtigt. Abbildung 3 zeigt die enzymatische Mt-DprE1-Oxidation von [14C]-DPR (Spur 1) zu [14C]-DPX (Decaprenylphosphoryl-2-ketoribose) (Spur 2). Dieses Zwischenprodukt ist ziemlich instabil und wandert als diffuses Band. Bei direkter Kopplung mit Mt-DprE2 wird [14C]-DPX in situ zu [14C]-DPA reduziert (Spur 3). Bei steigenden Konzentrationen von Ddn-aktiviertem Pretomanid (0–200 μM; Spuren 4–7) wurde eine dosisabhängige Hemmung der [14C]-DPA-Synthese beobachtet. In Gegenwart von 200 μM Pretomanid (nicht Ddn-aktiviert) war keine Hemmung der [14C]-DPA-Synthese zu beobachten (Spur 8). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Ddn-aktiviertes Pretomanid die Mt-DprE1-DprE2-abhängige Epimerisierung von DPR hemmt. Dies wird durch die Analyse mykobakterieller Zellwandextrakte (Arabinogalactan) nach [14C]-Markierung und Behandlung mit Pretomanid, Delamanid oder BTZ weiter bestätigt: Die relative Häufigkeit von Arabinose im Vergleich zu Galactose nimmt mit steigenden Arzneimittelkonzentrationen ab (ergänzende Abbildung 2). Dies deutet darauf hin, dass die DPA-Synthese negativ beeinflusst wurde. Interessanterweise führte die Hemmung der DPR-Epimerisierung durch Ddn-aktiviertes Pretomanid nicht zu einer erkennbaren Akkumulation von DPX, die mit der Hemmung von Mt-DprE2 allein einhergehen würde. Das Fehlen von DPX könnte einen Einblick in den Hemmmechanismus geben und wurde durch spektrophotometrische kinetische Analyse der Mt-DprE1- und Mt-DprE2-Aktivität weiter untersucht.

Die in vitro Mt-DprE1-DprE2-abhängige Epimerisierung von [14C]-DPR zu [14C]-DPA und die dosisabhängige Hemmung durch Ddn-aktiviertes Pretomanid wurde durch Autoradiographie-TLC (2000 cpm; entwickelt in CHCl3:CH3OH:NH4OH) analysiert: H2O (65:25:0,5:3,6, (v/v)); 14 Tage lang mit einem Kodak X-Omat-Film belichtet. Die Reaktionskomponenten jeder Spur werden zusammengefasst. Pretomanid-Prodrug wurde über Nacht bei Raumtemperatur in Gegenwart von Mt-DprE1/Mt-DprE1-DprE2, 200 μM NADPH und aktivierenden Komponenten (plus/minus Ddn) aktiviert. DPR, Decaprenylphosphoryl-D-Ribose; DPX, Decaprenylphosphoryl-2-ketoribose; DPA, Decaprenylphosphoryl-D-Arabinose. Quelldaten von 3 TLCs werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um DprE2 als Ziel von Ddn-aktiviertem Pretomanid weiter zu bestätigen und einen Einblick in den Hemmmechanismus zu gewinnen, wurden In-vitro-Assays zur Analyse der Mt-DprE1- und Mt-DprE2-Aktivität verwendet. Beide Tests verwenden das lösliche DPR-Analogon Geranylgeranylphosphoryl-D-Ribose (GGPR), wobei DprE1 GGPR in das DprE2-Substrat Geranylgeranylphosphoryl-2-ketoribose (GGPX) umwandelt. Die DprE1-Aktivität ist daher eine Voraussetzung für die DprE2-Aktivität. Der spektrophotometrische Assay für die DprE1-Aktivität misst die Resazurin-Reduktion durch den DprE1-FADH2-Cofaktor zu fluoreszierendem Resorufin (Anregung bei 530 nm, Emission bei 590 nm)26, während der DprE2-Assay die Oxidation des DprE2-NADPH-Cofaktors verfolgt (Anregung bei 340 nm, Emission bei 445 nm)25 (Abb. 4a).

a Schematische Darstellung der DprE1- und DprE2-Tests. Die DprE1-Aktivität wurde durch einen Fluoreszenztest gemessen, der die Reduktion von Resazurin zu fluoreszierendem Resorufin maß, während DprE1 GGPR unter Verwendung des Cofaktors FAD zum Keto-Zwischenprodukt GGPX oxidierte. Die DprE2-Aktivität wurde durch eine Änderung der Fluoreszenz aufgrund der Oxidation des DprE2-Cofaktors NADPH überwacht, da das Zwischenprodukt GGPX zum GGPR-Produkt reduziert wurde. GGPR, Geranylgeranylphosphoryl-D-Ribose; GGPX, Geranylgeranylphosphoryl-2-ketoribose; GGPA, Geranylgeranylphosphoryl-D-arabinose. b (i) NAD(H) ist für die Aktivierung von Pretomanid erforderlich. Die DprE2-Aktivität wurde nach 3-stündiger Pretomanid-Aktivierung bei 30 °C in Gegenwart verschiedener Kombinationen des Mt-DprE1-DprE2-Komplexes und der Co-Faktoren NADH, NADPH, NAD+ und NADP+ analysiert. Die Kontrollen (Reaktionsmischungen minus GGPR) wurden abgezogen, um die Hintergrundoxidation von NADPH zu entfernen. Die Reaktionen wurden dreifach durchgeführt (n = 3) (einzelne Datenpunkte der Replikate als graue Kreise dargestellt) und die mittleren Anfangsraten (μM NADPH oxidiert/min) mit dem Standardfehler wurden mit Prism GraphPad aufgezeichnet. b (ii) Messung der Stabilität des Enzym-Inhibitor-Komplexes durch Dialyse. Rohdaten, die die DprE2-Aktivität (Messung der NADPH-Oxidation) von Pretomanid-inhibiertem und nicht-inhibiertem Mt-DprE2 vor und nach der Dialyse zeigen. Aktivitätstests wurden in dreifacher Ausfertigung (n = 3) durchgeführt, wobei ein einziger repräsentativer Datensatz angezeigt wurde. Die Kontrolle (orange; ohne Ddn und GGPR) zeigt eine spontane NADPH-Oxidation. c DprE2-Assay zur Überwachung der DprE2-Aktivität im Mt-DprE1-DprE2-Komplex, d DprE1-Assay zur Überwachung der DprE1-Aktivität in (i) Mt-DprE1-DprE2-Komplex und (ii) Mt-DprE1 allein, in Gegenwart steigender Konzentrationen von Ddn-aktiviert und nicht aktiviertes Pretomanid (1,5 Stunden lang bei 30 °C aktiviert, bevor es zu Mt-DprE1-DprE2/Mt-DprE1 hinzugefügt wird). Die Tests in c und d wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt (n = 3) und Diagramme wurden mit [Inhibitor] (log10-Skala μM) vs. Reaktion aufgetragen und IC50 (halbmaximale Hemmkonzentration) berechnet, passend zu einer Dosis-Wirkungs-Kurve mit vier Parametern, unter Verwendung von Prism GraphPad. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Mt-DprE1-E2, Mt-DprE1-DprE2-Komplex.

Um die Anforderungen für die Aktivierung von Pretomanid zu untersuchen, wurden verschiedene Kombinationen der vorgeschlagenen natürlichen Cofaktoren DprE2, NADH und NADPH16 sowie der oxidierten Formen NAD+ und NADP+ (Abb. 4bi) mit dem Prodrug in Gegenwart von inkubiert Fehlen des Mt-DprE1-DprE2-Komplexes während der Aktivierung mit Ddn. Die anschließende Analyse der DprE2-Aktivität zeigte, dass in Abwesenheit von Mt-DprE1-DprE2 während der Aktivierung NADH oder NAD+ erforderlich war, um Pretomanid in eine aktive Form umzuwandeln, die die DprE2-Aktivität hemmen konnte. Weder NADPH noch NADP+ zeigten diese Fähigkeit. Wenn jedoch Mt-DprE1-DprE2 während der Ddn-Aktivierung vorhanden war, war die Zugabe eines Nicotinamid-Cofaktors nicht erforderlich, damit das Pretomanid die DprE2-Aktivität hemmt. Dies wurde auch mit den radioaktiven DPR-Epimerisierungstests gezeigt, bei denen NAD(H) nicht enthalten war. Dies führte uns zu dem Schluss, dass der aktive Metabolit von Pretomanid nicht wie bisher angenommen kurzlebig ist8, sondern in Abwesenheit von NAD(H) zu inaktiven Komponenten metabolisiert wird. Der Bedarf an Mt-DprE1-DprE2 während der Bildung eines aktiven Metaboliten in Abwesenheit von zusätzlichem NAD(H) legt nahe, dass der Komplex eine endogene Quelle des Cofaktors darstellt und dass NADH daher der natürliche Cofaktor für DprE2 ist. Es ist zu beachten, dass wir die NADPH-Oxidation weiterhin auf DprE2-Aktivität überwacht haben, da in unserem Test festgestellt wurde, dass Fgd1 NADH oxidiert (ergänzende Abbildung 3).

Um die Stabilität des Enzym-Inhibitor-Komplexes zu beurteilen, wurde der gehemmte Mt-DprE1-DprE2-Komplex (3-stündige Inkubation während der Pretomanid-Aktivierung) über Nacht dialysiert, um ungebundene Inhibitormoleküle und Derivate zu verdünnen. Die DprE2-Aktivität (Überwachung der NADPH-Oxidation) des gehemmten Mt-DprE1-DprE2-Komplexes (plus Ddn) wurde vor und nach der Dialyse mit der des ungehemmten Mt-DprE1-DprE2-Komplexes (minus Ddn) verglichen. Es gab keine erkennbare Auswirkung der Dialyse auf die Aktivität des gehemmten oder ungehemmten Mt-DprE1-DprE2-Komplexes (Abb. 4bii); Der inhibierte Komplex war nach der Dialyse immer noch inhibiert, mit einer Kurve, die der der Negativkontrolle ähnelte (nur spontane NADPH-Oxidation), und der nicht inhibierte Komplex zeigte eine mit der vordialysierten Probe vergleichbare Aktivität. Die Unfähigkeit des gehemmten DprE2, nach der Dialyse wieder seine Aktivität zu erlangen, lässt auf eine irreversible Hemmung schließen, bei der der Inhibitor extrem fest gebunden hat oder die chemische Zusammensetzung oder Tertiärstruktur des Enzyms dauerhaft verändert wurde.

Nachdem die Parameter der Pro-Drug-Aktivierung ermittelt wurden, wurde die Kinetik der aktivierten Pretomanid-Hemmung untersucht. Der DprE2-Assay wurde verwendet, um die DprE2-Aktivität als Teil des Mt-DprE1-DprE2-Komplexes zu analysieren; In Abwesenheit von DprE1 konnten wir aktives DprE2 nicht reinigen, und die DprE1-Aktivität ist eine Voraussetzung für die DprE2-Aktivität. Der DprE1-Assay wurde verwendet, um etwaige Auswirkungen des aktivierten Inhibitors auf den primären Schritt der GGPR-Epimerisierung zu bestimmen. In beiden Tests wurden steigende Konzentrationen von Pretomanid (0–50 μM) 1,5 Stunden lang bei 30 °C mit dem NAD+ und allen für die Pro-Drug-Aktivierung erforderlichen Komponenten inkubiert. Es wurden auch äquivalente Reaktionen unter Weglassung von Ddn vorbereitet, die die Umwandlung des Wirkstoffs in ein aktives Molekül verhinderten. In Gegenwart des Pretomanid-Prodrugs (nicht aktiviert) war Mt-DprE2-Aktivität offensichtlich. Bei der Aktivierung des Pretomanids durch Ddn kam es dagegen zu einer dosisabhängigen Verringerung der Mt-DprE2-Aktivität mit einem berechneten Wert der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) von 8,3 ± 0,2 μM (Abb. 4c; Rohdaten, ergänzende Abb. 4a). ) (± SEM). Als nächstes wurde die DprE1-katalysierte Resazurin-Reduktion verwendet, um die aktivierte Pretomanid-Hemmung der DprE1-Aktivität im Mt-DprE1-DprE2-Komplex zusammen mit einer etwaigen Hemmung von Mt-DprE1 allein zu bewerten (Abb. 4d; Rohdaten, ergänzende Abb. 4b und c). ). Es gab keine Hemmung der DprE1-Aktivität, weder mit Mt-DprE1 allein noch mit dem Mt-DprE1-DprE2-Komplex. Dies korreliert mit den Überexpressionsdaten, wonach steigende zelluläre DprE1-Spiegel keinen Einfluss auf die MHK von Pretomanid hatten. Der DprE1-Inhibitor BTZ (ergänzende Abbildung 5) zeigte eine Hemmung des DprE1-Assays sowohl für Mt-DprE1 als auch für Mt-DprE1-DprE2 (IC50-Werte von 11,8 ± 0,7 μM bzw. 24,0 ± 1,2 μM) (± SEM).

Um den Einfluss der Substratkonzentration zu vermeiden und die Art der Hemmung von DprE2 durch Pretomanid zu untersuchen, wurde die Ki (Inhibitorkonstante) durch Variation der Konzentration von GGPR und NADPH in zwei separaten Tests bestimmt (Abb. 5). Die Kurven wurden mit Prism GraphPad unter Verwendung des nichtlinearen Regressionsmodells für nichtkompetitive Hemmung für GGPR und kompetitive Hemmung für NADPH angepasst. Beide ergaben die beste Anpassung und korrelierten mit ihren entsprechenden doppelten reziproken Diagrammen. Der Ki wurde zu 4,9 ± 1,0 μM und 1,5 ± 0,4 μM für GGPR (Alpha Ki) bzw. NADPH (± SEM) berechnet.

Die Pretomanid-Hemmung wurde durch eine Titration des Inhibitors und der beiden Substrate a GGPR und b NADPH durchgeführt. Steigende Konzentrationen von Pretomanid wurden 1,5 Stunden lang bei 30 °C mit NAD+ und den anderen aktivierenden Komponenten und entweder 100 μM oder einer Titration von NADPH inkubiert. Der Mt-DprE1-DprE2-Komplex wurde mit dem aktivierten Pretomanid 10 Minuten lang inkubiert und die DprE2-Aktivität nach Zugabe von 200 μM oder einer Titration von GGPR gemessen. Die Tests wurden in dreifacher Ausfertigung (n = 3) durchgeführt und die mittleren Anfangsraten (μM NADPH oxidiert/min) mit dem Standardfehler wurden mit Prism GraphPad aufgetragen, wobei die Kurve unter Verwendung des Modells für nichtkompetitive Hemmung (GGPR) und kompetitive Hemmung (NADPH) angepasst wurde ). (i) Die angepasste Kurve und (ii) doppelte reziproke Darstellung. Die Hintergrundoxidation von NADPH wurde abgezogen. GGPR, Geranylgeranylphosphoryl-D-Ribose; Ki, Inhibitorkonstante. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Unsere ersten Versuche für diese Tests, bei denen Mt-DprE1 oder Mt-DprE1-DprE2 während der Aktivierung 3 Stunden lang mit Pretomanid inkubiert wurden (ergänzende Abbildung 6), zeigten, dass zusätzlich zur Hemmung des DprE2-Tests eine Verringerung der DprE1-Aktivität eintrat für den Mt-DprE1-DprE2-Komplex wurde ebenfalls beobachtet (IC50 von 25 ± 6,2 μM) (± SEM), allerdings nicht für Mt-DprE1 allein. Es gab auch einen Unterschied in den Ki-Kurven und reziproken Diagrammen, die für nichtkompetitive Hemmung angepasst wurden, mit berechneten Ki-Werten von 16,4 ± 1,9 μM und 14,1 ± 1,9 μM für GGPR bzw. NADPH (± SEM). Diese höheren Werte stellen wahrscheinlich einen Mangel an NAD+ dar, der für die Aktivierung von Pretomaniden erforderlich ist, was zusätzliche Tests erforderlich macht.

Wir haben bestätigt, dass DprE2 ein Ziel zweier neuer klinisch relevanter Mtb-Medikamente ist, Delamanid und Pretomanid, und zwar mithilfe von Studien zur Bindung ganzer Zellen und In-vitro-Enzymaktivitätstests. Die Zielidentifizierung war für diese Medikamente problematisch, da spontane Tests auf resistente Mutanten auf den Ddn-Aktivierungsweg und nicht auf das wahre Ziel hindeuteten10,11,12. Erst als bekannte Inhibitoren von DprE2 ähnliche Resistenzprofile erzeugten, wurde die Möglichkeit erkannt, dass diese Verbindungen alle ein gemeinsames Ziel haben25. DprE2 bildet zusammen mit DprE1 einen essentiellen Epimerasekomplex im Syntheseweg von DPA, einem lipidgebundenen Arabinosedonor für die entscheidende Mtb-Zellwandkomponente Arabinogalactan18,19,20,21. Frühere Studien, die eine Verringerung der Mykolsäuren in medikamentenbehandelten Zellen zeigten6,7, lagen tatsächlich nahe am Ziel, da eine Verringerung des Arabinosegehalts der Arabinogalactan-Domäne wahrscheinlich die Bindungsstellen der Mykolsäure verringert. Eine weitere Validierung von DprE2 als Ziel liefern metabolische Studien, die einen Anstieg der Ribose-5-phosphat-Spiegel in mit Pretomanid behandelten Zellen berichteten27. Ribose-5-phosphat ist eine Vorstufe im Syntheseweg von DPA und könnte sich theoretisch ansammeln, wenn der nachgeschaltete Weg blockiert würde.

Die Pretomanid-Hemmung wurde sowohl durch den spektrophotometrischen DprE2-Test als auch durch den radioaktiv markierten Test nachgewiesen. Obwohl hier die IC50- und Ki-Werte angegeben wurden, bedeutet die komplexe Aktivierung des Pretomanid-Prodrugs durch Ddn in mehrere verschiedene Spezies, dass die tatsächliche Konzentration des aktiven Medikaments nicht absolut ist. Während es weder für Mt-DprE1 noch für den Mt-DprE1-DprE2-Komplex eine Auswirkung auf die DprE1-Aktivität gab, wenn voraktiviertes Pretomanid vor dem Test hinzugefügt wurde, wurde der Mt-DprE1-DprE2-Komplex währenddessen auf ein Drittel der normalen Aktivität gehemmt Tests, bei denen der Komplex während der Pretomanid-Aktivierung 3 Stunden lang inkubiert wurde. Die Methode der Pretomanid-Aktivierung war auch für den beobachteten Hemmmodus, der für die Ki-Tests berechnet wurde, von Bedeutung. Nach einer kurzen Inkubationszeit mit dem aktivierten Pretomanid zeigten DprE2-Assays, dass der Wirkstoff mit dem NADPH um das aktive Zentrum konkurrierte, während der Wirkstoff eine nicht-kompetitive Hemmung mit GGPR zeigte. Nach einer längeren Inkubationszeit während der Pretomanid-Aktivierung war die Hemmung für beide Substrate nicht kompetitiv. Dieser Wechsel in der Hemmung könnte auf eine langsame Änderung des Bindungsmodus des aktivierten Pretomanids von einer anfänglichen schwachen Bindung zu einer stärkeren Bindung hinweisen, ein Merkmal, das beim InhA-Inhibitor Isoniazid beobachtet wurde, von dem angenommen wird, dass er fest bindet, sobald sich der endgültige gehemmte Komplex gebildet hat28. Tatsächlich erwies sich der Enzym-Inhibitor-Komplex, der sich während einer langen Inkubation zwischen aktiviertem Pretomanid und DprE2 bildete, als äußerst stabil und überstand eine lange Dialyseperiode, die zur Verdünnung einer schwach gebundenen Verbindung dienen würde. Ein fester gebundenes Pretomanid könnte auch die nach einer langen Inkubation mit Pretomanid beobachtete Hemmung der DprE1-Aktivität erklären. Ein fest gebundener Inhibitor könnte den Substrattransfer von DprE1 zu DprE2 verhindern und dadurch die Mt-DprE1-Aktivität blockieren, eine Theorie, die durch das Fehlen einer DPX-Akkumulation in unseren DPR-Epimerisierungsstudien gestützt wird.

Wir haben uns bemüht, den aktiven Metaboliten von Pretomanid und Delamanid zu etablieren, und obwohl dies noch nicht durch Massenspektrometrie bestätigt wurde, deuten unsere Ergebnisse stark darauf hin, dass es sich um das zuvor entdeckte NAD-Addukt handelt9,16. Dies wäre nicht der erste Fall eines solchen Addukts, das für Isoniazid und Ethionamid während der InhA-Hemmung berichtet wurde28,29,30,31. Da DprE2 NADH/NADPH als Cofaktoren nutzen kann, würde ein NAD-Pretomanid-Addukt die anfängliche konkurrierende Bindung erklären, die für NADPH beobachtet wird, und auch die Notwendigkeit von DprE2, wenn NAD(H) nicht vorhanden ist, was eine NAD(H)-Quelle für das Addukt darstellt Bildung während der Aktivierung. Dieser Befund impliziert auch, dass NADH der natürliche Cofaktor für DprE2 ist, da hier bestätigt wird, dass NADPH kein inhibitorisches Addukt mit Pretomanid9 bilden kann, sondern nur eine endogene Versorgung mit NAD(H) aus dem Enzym die aktive Spezies bilden kann. Die Trennung von Pretomanid-Aktivierung und Hemmung von DprE2 weist auch darauf hin, dass die aktive Form nicht so kurzlebig ist wie ursprünglich angenommen8. Strukturanalysen der Pretomanid- und Delamanid-Prodrugs sowie unserer kürzlich entdeckten DprE2-Inhibitoren25 zeigen, dass sie eine gemeinsame Nitrogruppe haben (hervorgehoben in Abb. 1a), die an einen aromatischen Ring gebunden ist. Wir vermuten, dass es diese Einheit ist, die durch Ddn während der Arzneimittelaktivierung reduziert wird, wie bereits vermutet9. Die alternative Möglichkeit, dass Pretomanid zu einem kurzlebigen Nitrosoderivat reduziert wird, das direkt mit dem Enzym reagiert, wie es bei der BTZ-Hemmung von DprE125,32 beobachtet wurde, scheint mit den hier präsentierten Ergebnissen weniger wahrscheinlich. Allerdings können wir auch nicht ausschließen, dass die Vielzahl anderer Metaboliten, die durch die Ddn-Aktivierung von Pretomanid und Delamanid gebildet werden, Teil des vielschichtigen Abtötungsmechanismus sein könnten. Diese Möglichkeiten sind alle Gegenstand zukünftiger Untersuchungen.

Trotz konzertierter Bemühungen auf diesem Gebiet gehören Pretomanid und Delamanid zu den ersten neuen Medikamenten, die seit über 40 Jahren zugelassen wurden, insbesondere für Patienten mit MDR- und XDR-Mtb-Stämmen, die gegen die aktuellen Medikamente der ersten und zweiten Wahl resistent sind. Die Entdeckung, dass DprE2 ein Ziel dieser beiden neuen Antibiotika ist, zeigt einmal mehr das Ausmaß der Medikamentenfähigkeit des DprE1-DprE2-Komplexes. Wir gehen davon aus, dass dieser Befund zusammen mit den zunehmenden Beweisen für das NAD-Addukt als aktive Einheit die Entdeckungsbemühungen für diese klinisch vielversprechenden Pro-Drugs beschleunigen und weitere Untersuchungen zur Entwicklung neuer Derivate des klinisch erfolgreichen Pretomanid und Delamanid unterstützen wird.

Alle vom Plattenlesegerät POLARstar Omega (BMG Labtech) gesammelten Daten wurden in Microsoft Excel 16.66.1 und GraphPad Prism 9.5.1 analysiert.

Der M. bovis BCG-Stamm Pasteur wurde in statischem Flüssigmedium (Middlebrook 7H9 (Difco), 10 % (v/v) Middlebrook ADC, 0,25 % (v/v) Glycerin, 0,05 % (v/v) Tween-80) kultiviert 37 °C, 5 % CO2. Das Medium wurde mit 25 μg/ml Kanamycin ergänzt, um auf mykobakterielle Plasmide zu selektieren.

Für Überexpressionsstudien wurden Mykobakterien mit mykobakteriellen Expressionskonstrukten elektroporiert. Kurz gesagt, elektrokompetente Mykobakterien wurden durch Pelletieren und Waschen einer Mid-Log-Kultur von Mykobakterien mit abnehmenden Volumina 10 % (v/v) Glycerin bei Raumtemperatur hergestellt. Die Zellen wurden in eine Elektroporationsküvette mit 0,1 cm Elektrodenabstand überführt, mit 1 μg Plasmid-DNA 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, bevor ein einzelner Impuls von 1,8 kV angelegt wurde. Die Zellen wurden über Nacht in flüssigen Medien gewonnen, bevor sie auf festem Medium mit 25 μg/ml Kanamycin selektiert wurden.

Der mykobakterielle Expressionsvektor pMV261-Mt-dprE1 wurde unter Verwendung der Primer (Sense CTAGCTAGGGATCCAATGTTGAGCGTGGGAGCTAC, BamHI; Antisense CTAGCTAGAAGCTTCTACAGCAGCTCCAAGCGTCG, HindIII)26 konstruiert, pMV261-Mt-dprE2 wurde mit den Primern (Sense CTAGCTAGGGATCCAATGGTTCTTGATGCCGTAGG) konstruiert , BamHI; Antisense CTAGCTAGAAGCTTTCAGATGGGCAGCTTGCGGAAG, HindIII)25 und pMV261-Mt-inhA wurde mit den Primern (sense GATCGATCGGATCCAATGACAGGACTGCTGGACGG, BamHI; antisense GATCGATCAAGCTTCTAGAGCAATTGGGTGTGCGC, HindIII) konstruiert. Der Escherichia coli-Expressionsvektor pcdf-duet-mt-dpre1 wurde unter Verwendung von Primern konstruiert (Sense gatcgatcggatccgatgtttgagcgtgggagctaccaccg, Bamhi erzeugt durch zusätzliches Klonieren des Gens, das Mt- codiert DprE2 unter Verwendung der Primer (sense CATGCATGCATATGGTCCTGGATGCTGTGGGC, NdeI; antisense CATGCATGCTCGAGTCAAATCGGCAGTTTACGG, XhoI)25. Das für Mt-Ddn kodierende Gen wurde in die Expressionskonstrukte pVV16 (Sense-Primer, GATCGATCCATATGCCGAAATCACCGCCGCGGTTTC, NdeI; TC, BamHI; Antisense-Primer, GATCGATCAAGCTTTCAGGGTTCGCAAACCACGATCGGG, HindIII), jeweils. Das für Mt-Fgd1 kodierende Gen wurde in das E. coli-Expressionskonstrukt pET28a kloniert (Sense-Primer, GATCGATCCATATGGCTGAACTGAAGCTAGGTTACAAAGC, NdeI; Antisense-Primer, GATCGATCAAGCTTTCAGCCAAGTCGCCGCAACC, HindIII). Gemäß den Anweisungen des Herstellers (Q5 High Fidelity DNA Polymerase, New England Biolabs) wurden Gene durch PCR aus genomischer Mtb H37Rv-DNA amplifiziert, gereinigt (QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen) und die PCR-Produkte und Vektoren mit den angegebenen Restriktionsenzymen verdaut (FastDigest, Thermo Fisher Scientific). Die Verdauungsprodukte wurden gereinigt, ligiert (T4-DNA-Ligase, New England Biolabs) und in E. coli TOP10-Zellen transformiert. Positive Klone wurden aus festem Medium (LB-Agar mit 50 μg/ml Kanamycin) ausgewählt und die Konstrukte wurden durch DNA-Sequenzierung (Source Bioscience) verifiziert.

Die rekombinanten Proteine ​​SUMO-Ddn und Fgd1 wurden in E. coli BL21 (DE3)-Zellen (aus pET28SUMO bzw. pET28a) überexprimiert. Die Zellen wurden in Terrific-Brühe bei 37 °C unter Schütteln bis zu einem OD600 nm von 0,4–0,6 kultiviert. Die rekombinante Proteinproduktion wurde mit 1 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert und die Zellen wurden über Nacht bei 16 °C kultiviert und anschließend geerntet.

Rekombinante Proteine ​​wurden durch Nutzung des vektorkodierten His-Tags gereinigt. Zellpellets wurden in Bindungspuffer (50 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 0,5 M NaCl, 25 mM Imidazol) resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation bei 40.000 × g und 4 ° C entfernt, und das geklärte Lysat wurde auf eine 1 ml mit Nickel beladene immobilisierte Metallaffinitätschromatographiesäule (IMAC) (HisTrap IMAC HP, GE Healthcare) aufgetragen, die in Bindungspuffer voräquilibriert war. Die Säule wurde gewaschen und das rekombinante Protein unter Verwendung eines Stufengradienten von Imidazol in Bindungspuffer (25, 50, 100, 150, 200, 1000 mM) eluiert. Fraktionen, die gereinigte rekombinante Proteine ​​enthielten, wurden in 50 mM Tris, pH 7,5, 500 mM NaCl, 10 % Glycerin dialysiert. Um den His-markierten SUMO-Löslichkeitsmarker von Ddn zu entfernen, wurde SUMO-Protease während der Dialyse in das gereinigte rekombinante SUMO-Ddn einbezogen. IMAC wurde mit Bindungspuffer und einem Stufengradienten von Imidazol (0, 10, 25, 50, 100, 300, 1000 mM) wiederholt, um Ddn von SUMO-Ddn und der His-markierten SUMO-Protease zu trennen. Fraktionen, die gereinigtes Ddn enthielten, wurden in 50 mM Tris, pH 7,5, 500 mM NaCl, 10 % Glycerin dialysiert. Rekombinantes Ddn und Fgd1 wurden konzentriert und bei –20 ° C gelagert.

Mt-DprE1 allein und der Mt-DprE1-DprE2-Komplex wurden zusammen mit den Chaperonen des pTrc-60.2-groES-Plasmids vom pCDF-Duett-Vektor in E. coli BL21 (DE3)-Zellen exprimiert25,32,33. Die Zellen wurden bei 37 °C unter Schütteln bis zur mittleren logarithmischen Phase in Terrific-Brühe (Difco) gezüchtet, mit Spectinomycin (100 µg/ml) und Ampicillin (100 µg/ml) ergänzt und dann in einem Kühlschrank auf 20 °C abgekühlt Eisbad. Die Expression wurde über Nacht bei 20 °C mit 0,5 mM IPTG induziert, bevor die Zellen pelletiert wurden. Zellpellets wurden in Lysepuffer (50 mM Tris-HCL (pH 8), 50 mM NaCl und 10 % Glycerin) resuspendiert, auf Eis beschallt, das unlösliche Material bei 75.000 × g, 4 °C pelletiert und das lösliche Material durch a geleitet HisTrap-Spalte. Die Proteine ​​wurden in Lysepuffer mit 20 mM Imidazol gewaschen und mit 300 mM Imidazol eluiert. Ein weiterer Reinigungsschritt wurde mit einer QHP-Säule in Lysepuffer mit steigenden NaCl-Konzentrationen durchgeführt. Der Mt-DprE1-DprE2-Komplex passiert die Säule direkt, während Mt-DprE1 allein bei 120–140 mM NaCl eluiert. Die Proteine ​​wurden in Lysepuffer mit 200 mM NaCl dialysiert, konzentriert und bei –80 °C gelagert.

Die flüssige MHK von mykobakteriellen Überexpressionsstämmen (M. bovis BCG mit den Expressionskonstrukten pMV261, pMV261-Mt-dprE1, pMV261-Mt-dprE2 und pMV261-Mt-inhA) mit verschiedenen Verbindungen wurde mithilfe des Mikrotiterplatten-Alamar-Blue-Assays bewertet ( MABA). Kurz gesagt, Mid-Log-Zellen (OD600nm 0,4–0,8) wurden im angegebenen flüssigen Wachstumsmedium auf 1 × 106 koloniebildende Einheiten (KBE)/ml (OD600nm von 1, entspricht 2,5 × 108 KBE/ml) verdünnt. 99 μl Zellen wurden zusammen mit 1 μl der 100-fachen gewünschten Konzentration der Verbindung in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte (schwarze Wände, schwarz, flacher Boden; Greiner) gegeben (steigende Konzentrationen über die Platte). Alle Verbindungen wurden in 100 % DMSO gelöst, mit Ausnahme von Isoniazid, das in Wasser gelöst wurde. Die Platten wurden 7 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. 30 μl 0,02 % (w/v) Resazurin und 12,5 μl 20 % Tween 80 wurden in jede Vertiefung gegeben und die Platten wurden weitere 24 Stunden lang inkubiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Messung der Fluoreszenz (λ-Anregung 530 nm, λ-Emission 590 nm) mit einem POLARstar Omega-Plattenlesegerät ermittelt. Die Daten wurden mithilfe einer nichtlinearen Regression (Prism, GraphPad) angepasst.

Mid-log (OD600nm 0,4–0,8) M. bovis BCG, das die Expressionskonstrukte pMV261, pMV261-Mt-dprE1 oder pMV261-Mt-dprE2 beherbergt, wurde auf 1 × 106 koloniebildende Einheiten (KBE)/ml verdünnt. In einer Platte mit 96 Vertiefungen wurden 99 μl Zellen dreifach mit der gewünschten Wirkstoffkonzentration von Pretomanid, Delamanid, BTZ oder INH behandelt und 7 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Zellen wurden resuspendiert und 5 μl jeder Suspension wurden gezielt auf 7H11-Agar mit 25 μg/ml Kanamycin getüpfelt. Weitere 5 μL wurden seriell von 10–1 auf 10–6 verdünnt. Vor dem Auftragen auf feste Medien. Die Agarplatten wurden 2 Wochen lang bei 37 °C inkubiert, bevor die KBE gezählt wurden.

Die Wirkung von Pretomanid und Delamanid auf die Arabinogalactan-Biosynthese ganzer Zellen wurde mithilfe der [14C]-Markierung bewertet. Die Studie wurde mit Mycobacterium smegmatis mc2155 durchgeführt, da M. bovis BCG nicht in der Lage ist, die erforderliche Radiomarkierung ([14C]-Glucose) aufzunehmen. Wildtyp-M. smegmatis ist von Natur aus resistent gegen Pretomanid und Delamanid und daher wurde M. smegmatis, der das mykobakterielle Expressionskonstrukt pVV16-ddn beherbergt, in den Markierungsexperimenten verwendet: Eine konstitutive Ddn-Überexpression ermöglichte die Aktivierung von Medikamenten, wodurch die MHK von Delamanid reduziert wurden >10 μM bis 0,5 μM und Pretomanid von >200 μM bis 2,5 μM.

Der M. smegmatis-Stamm mc2155 wurde in statischer oder schüttelnder flüssiger Luria-Burtani (LB)-Brühe mit 0,05 % (v/v) Tween-80- oder Glycerol-Alanin-Salz (GAS)-Medien (Bacto-Casiton, 100 μM Eisen-Ammoniumcitrat, 23 mM K2HPO4, 10 mM Zitronensäure, 11 mM L-Alanin, 6 mM MgCl2−6H2O, 3 mM K2SO4, 37 mM NH4Cl, 1 % (v/v) Glycerin, pH 6,6) mit 0,05 % (v/v) Tween -80 bei 37 °C. Für das Wachstum auf festem Medium wurde LB-Agar verwendet. Das Medium wurde mit 25 μg/ml Kanamycin ergänzt, um auf das mykobakterielle Plasmid pVV16-ddn zu selektieren.

Das pVV16-ddn-mykobakterielle Expressionskonstrukt wurde unter Verwendung von Standardklonierungsverfahren (Sense-Primer, GATCGATCCATATGCCGAAATCACCGCCGCGGTTTC, NdeI; Antisense-Primer, GATCGATCAAGCTTGGGTTCGCAAACCACGATCGGG, HindIII) erzeugt und in M. smegmatis elektroporiert.

M. smegmatis mc2155, der den Vektor pVV16-ddn beherbergt, wurde bis zur mittleren logarithmischen Grenze (OD600 nm 0,4–0,8) kultiviert und auf OD600 nm 0,2 verdünnt. 10-ml-Zellkulturen wurden 6 Stunden lang mit einer dosisabhängigen Erhöhung des Arzneimittels (0x, 0,5x und 1x MHK; MHKs: Delamanid, 0,5 μM; Pretomanid, 2,5 μM; BTZ, 15 nM) behandelt, bevor 1 μCi/ml [14C] hinzugefügt wurde ]-D-Glucose (PerkinElmer) für weitere 16 Stunden. Die Zellen wurden geerntet und die Pellets in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Die Zellen wurden 2 Stunden lang dreimal in 3 ml 2:1 Chloroform:Methanol bei 50 °C extrahiert. Das Pellet wurde 1 Stunde lang dreimal mit 1 ml 50 %igem (Vol./Vol.) Ethanol bei 80 °C und anschließend 1 Stunde lang dreimal mit 1 ml 2 %igem (Gewicht/Vol.) SDS bei 90 °C behandelt. Das Pellet wurde dann in 1 ml 80 % (v/v) Aceton resuspendiert, das Lösungsmittel verworfen und in 1 ml 100 % (v/v) Aceton resuspendiert. Das Lösungsmittel wurde verworfen und das Pellet anschließend getrocknet. Das Arabinogalactan-Pellet wurde 3 Stunden lang in 300 μl 2 M Trifluoressigsäure bei 120 °C hydrolysiert. Die Trifluoressigsäure wurde verdampft und die resultierenden Zucker wurden durch TLC (aluminiumgestütztes HPTLC-Kieselgel 60 F254) in 15:1 (v/v) Aceton:Wasser unter Verwendung gleicher Zählungen (50.000 cpm) analysiert und Kodak X ausgesetzt -Omat-Film für 5 Tage. Zucker wurden anhand von Kaltstandards identifiziert. Die relative Häufigkeit von Arabinose und Galaktose wurde durch Densitometrie bestimmt.

Die Pretomanid-Hemmung von DprE2 in Gegenwart von DprE1 wurde durch Überwachung der Umwandlung von [14C]-DPR in [14C]-DPA behoben. [14C]-DPR wurde wie zuvor hergestellt34: 100 μCi (100 mCi/mmol) getrocknete [14C]-Glucose (PerkinElmer) wurden in 800 μL Puffer (50 mM Hepes pH 7,6, 2 mM MgCl2 und 0,5 mM MnCl2) resuspendiert. Zugabe von 10 Einheiten Hexokinase, 2 mM ATP, 8 mM NADP. Nach einer 2-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden 10 Einheiten Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, 2 Einheiten 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase, 10 Einheiten Phosphoriboisomerase und 1 Einheit Phosphoribosylpyrophosphat-Synthetase zugegeben und die Mischung 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert . Weitere 3 mM ATP wurden langsam über eine Stunde zugegeben. Das resultierende p[14C]Rpp wurde durch einen 1,5-ml-10-kDa-Zentrifugenfilter (Amicon) filtriert, um die Enzyme zu entfernen, und unter Verwendung einer 3-ml-LC-SAX-SPE-Säule (Merck) von Zwischenreaktionsprodukten und Substraten getrennt und mit Wasser gewaschen und Eluieren mit einem Gradienten von Natriumacetat in Wasser (300 mM bis 2 M). Die Fraktionen wurden auf einer glasunterstützten Zellulose-TLC sichtbar gemacht, in 0,85 M Phosphatpuffer, dessen pH-Wert mit Phosphorsäure auf 3,4 geändert wurde, aufgetrennt und eine Nacht lang einem Kodak X-Omat-Film ausgesetzt. 1 Million p[14C]Rpp-Zählungen wurden durch Inkubation mit 100 μl BTZ-inhibierten M. smegmatis-Membranen (100 μM BTZ in insgesamt 300 μl 50 mM MOPs-Puffer pH 7,9, 1 mM ATP, 10 Minuten bei 37 °C vorinkubiert) und 15 μL Decaprenylphosphat (C50-P) (1 mM in 1 % CHAPs) für 1,5 Stunden bei 37 °C. [14C]-DPR wurde durch Zugabe von 3,7 ml 10:10:3 (CHCl3:CH3OH:H2O) (v/v) und 8-stündiges Inkubieren bei Raumtemperatur abgetrennt. Dann wurden 750 μL H2O und 1,75 ml CHCl3 zugegeben, um eine Zweiphase zu bilden, wobei die untere organische Schicht zweimal mit 3:47:48 (CHCl3:CH3OH:H2O) (v/v) gewaschen und die untere organische Fraktion getrocknet wurde.

Steigende Konzentrationen von Pretomanid (0, 50, 100, 200 μM) wurden über Nacht bei Raumtemperatur in Puffer (50 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 100 mM NaCl) mit 4 μM Fgd1, 36 μM F420, 1 mM Glucose-6- aktiviert. Phosphat, 5 μM Ddn, 300 μM NADPH, 10 μM Mt-DprE1-DprE2. Es wurden auch Kontrollreaktionen vorbereitet: (Spur 1) Reaktionspuffer; (Spur 2) Reaktionspuffer mit 10 μM Mt-DprE1, 300 μM NADPH; (Spur 3) Reaktionspuffer mit 10 μM Mt-DprE1-DprE2, 300 μM NADPH; (Spur 8) 200 μM Pretomanid in Abwesenheit von Ddn. Die Reaktionen wurden mit 5 μL GGPR und 5,5 μL [14C]-DPR (2.000 cpm) in 1 % IGEPAL für 1 Stunde bei 37 °C gestartet und dann mit 350 μL CHCl3:CH3OH (2:1 (v/v) gequencht )). Die untere Schicht der Biphase wurde getrocknet, in 10 μl CHCl3:CH3OH (2:1) (v/v) resuspendiert, auf ein Hochleistungs-Silica-DC (Merck) getupft und durch CHCl3:CH3OH:NH4OH:H2O (65) getrennt :25:0,5:3,6, (v/v)). Die Streifen wurden nach zweiwöchiger Belichtung mit einem Kodak X-Omat-Film sichtbar gemacht.

Pretomanid wurde 1,5 Stunden lang bei 30 °C in Gegenwart von NAD+ aktiviert. Die folgenden Reagenzien wurden zu einem Endvolumen von 22 μl hinzugefügt: Reaktionspuffer (50 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 4 mM MgCl2, 100 mM NaCl), 5 μM Fgd1, 12 μM F420, 1 mM Glucose-6-phosphat und 200 μM NAD+. 1 μl seriell verdünntes Pretomanid in DMSO wurde mit steigenden Konzentrationen in einem Dosis-Wirkungs-Format (0, 0,78, 1,56, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 μM) hinzugefügt. 5 μM Ddn leiteten die Aktivierung des Prodrugs ein. Äquivalente Kontrollreaktionen wurden in Abwesenheit von Ddn hergestellt. Das aktive Pretomanid-Arzneimittel wurde dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur entweder mit 10 μM Mt-DprE1 allein oder 10 μM Mt-DprE1-DprE2-Komplex inkubiert. Als nächstes wurden 100 μM NADPH hinzugefügt und die DprE126- und DprE225-Tests durchgeführt, wobei die Testmischung (23 μl) in Greiner 384-Platten mit schwarzem Boden aliquotiert wurde. Für den DprE1-Assay wurden den Reaktionen 100 μM Resazurin (2 mM Stammlösung) zugesetzt, bevor sie auf die Platte geladen wurden. Die Reaktionen wurden gemessen (DprE2-Assay: λ-Anregung 340 nm, λ-Emission 445 nm; DprE1-Assay: λ-Anregung 530 nm, λ-Emission 590 nm), 37 °C, unter Verwendung eines Plattenlesegeräts POLARstar Omega (BMG Labtech). Die Reaktion wurde durch Zugabe von 200 μM GGPR (2,5 mM Stammlösung) unter Verwendung einer Mehrkanalpipette gestartet. Die Reaktionen wurden dreifach durchgeführt.

Tests zur Bestimmung des Ki mit unterschiedlichen Substratkonzentrationen wurden wie oben durchgeführt, wobei steigende Konzentrationen von Pretomanid (0, 5, 10, 25, 50, 75, 100 μM) verwendet und mit 200 μM NAD+ für 1,5 Stunden bei 30 °C inkubiert wurden die aktivierenden Enzyme und Inhaltsstoffe. Nach einer 10-minütigen Inkubation des aktiven Pretomanids mit dem Mt-DprE1-DprE2-Komplex bei Raumtemperatur wurde die DprE2-Aktivität nach Zugabe von 100 μM NADPH und einer Titration von GGPR (0, 25, 50, 75, 100, 150, 200 μM) oder 200 μM GGPR und eine Titration von NADPH (6,125, 12,5, 25, 50, 100, 200 μM) (λ-Anregung 340 nm, λ-Emission 445 nm) bei 37 °C unter Verwendung eines POLARstar Omega (BMG Labtech) Plattenleser. Die Reaktionen wurden dreifach durchgeführt.

Für den Aktivierungsbedarfstest wurden 200 μM Pretomanid mit den aktivierenden Enzymen und Bestandteilen 3 Stunden lang bei 30 °C inkubiert, entweder mit 100 μM NADH, NADPH, NAD+, NADP+ oder ohne Nicotinamid-Cofaktor, plus/minus 10 μM Mt-DprE1- DprE2-Komplex und plus/minus 10 μM Ddn. Nach der Pretomanid-Aktivierung wurde der 10 μM Mt-DprE1-DprE2-Komplex 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit den Assays inkubiert, denen der Komplex fehlte. Zu jedem Assay wurden 100 μM NADPH hinzugefügt (sofern nicht bereits vorhanden) und die DprE2-Aktivität wurde nach der Zugabe von 200 μM GGPR (2,5 mM Stammlösung) gemessen. Die Reaktionen wurden dreifach durchgeführt.

Bei den ersten Tests schien DprE2 erforderlich zu sein, und es war nicht bekannt, dass NAD(H) notwendig ist. Daher wurde Pretomanid in Gegenwart des Mt-DprE1-DprE2-Komplexes (oder Mt-DprE1 allein) 3 Stunden lang bei 30 °C in Gegenwart von 100 μM NADPH und den anderen Komponenten zur Aktivierung (50 mM Natriumphosphat, pH-Wert) aktiviert 7,5, 4 mM MgCl2, 100 mM NaCl), 5 μM Fgd1, 5 μM Ddn, 12 μM F420, 1 mM (Glucose-6-phosphat) in einem Endvolumen von 22 μL. Die IC50-Werte wurden durch Zugabe von 1 μl steigender Konzentrationen von Pretomanid gemessen. Ki-Assays wurden auch durchgeführt, indem auf diese Weise eine Titration von Pretomanid aktiviert wurde, wobei entweder NADPH während des Aktivierungszeitraums oder GGPR titriert wurde, um die Reaktion zu starten, während das andere Substrat konstant gehalten wurde. Die DprE1- und DprE2-Aktivität wurde als normal gemessen.

Für das Dialyseexperiment wurde die Testmischung auf 1 ml erhöht, wobei die Konzentrationen aller Testkomponenten konstant blieben. Der Mt-DprE1-DprE2-Komplex wurde mit 400 μM Pretomanid plus und minus dem Ddn-Aktivator gehemmt. Nach einer 3-stündigen Inkubation bei 30 °C wurde die Hälfte jedes Tests über Nacht in 50 mM Kaliumphosphat, 500 mM KCl, 10 % Glycerin bei 4 °C unter Verwendung eines 14-kDa-Cut-off-Dialyseschlauchs (Sigma) dialysiert. Die andere Hälfte der Mischung wurde bei 4 °C gelagert. Die OD280nm wurde für jede Probe mit einem Nanotropfen gemessen und die Konzentration der Proben vor der Dialyse wurde mit dem Dialysepuffer reduziert, um den Verdünnungseffekt der Dialyse zu berücksichtigen. 20 μl der Proben wurden vor und nach der Dialyse in Greiner 384-Platten mit schwarzem Boden geladen und die dialysierte Probe mit 100 μM NADPH versetzt. Die Reaktion wurde mit 200 μM GGPR (1 mM Stammlösung) gestartet und die DprE2-Aktivität (λ-Anregung 340 nm, λ-Emission 445 nm) bei 37 °C unter Verwendung eines POLARstar Omega (BMG Labtech)-Plattenlesegeräts gemessen. Die Reaktionen wurden dreifach durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Daten (Abb. 2, Fluoreszenzzahlen und KBE; Abb. 3, unbeschnittene TLC; Abb. 4 und 5, Fluoreszenzzahlen; ergänzende Abb. 1, Fluoreszenzzahlen und KBE; ergänzende Abb. 2, Densitometriewerte; Ergänzende Abbildungen 3, 4, 5 und 6 (Fluoreszenzzählungen) sind diesem Dokument in der Quelldatendatei beigefügt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Die Autoren danken Albel Singh für das Fotografieren von TLCs für die Abbildungen. Die Finanzierung wurde wie folgt vergeben: Personal Research Chair von Herrn James Bardrick, GSB Medical Research Council MR/S000542/1, GSB Medical Research Council MR/R001154/1, GSB Sir Charles Hercus Health Research Fellowship, verliehen durch den Health Research Council of Neuseeland, GB

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Katherine A. Abrahams, Sarah M. Batt.

Institut für Mikrobiologie und Infektion, School of Biosciences, University of Birmingham, Edgbaston, Birmingham, B15 2TT, Großbritannien

Katherine A. Abrahams, Sarah M. Batt, Sudagar S. Gurcha, Natacha Veerapen und Gurdyal S. Besra

Labor für molekulare und mikrobielle Biochemie, School of Biological Sciences, University of Auckland, 3A Symonds Street, Auckland, 1010, Neuseeland

Ghader Bashiri

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Konzeptualisierung: KAA, SMB, GSB Methodik: KAA, SMB, GSB Untersuchung: KAA, SMB, SS, NV, GB, GSB Visualisierung: KAA, SMB, GSB Überwachung: GSB Writing – Originalentwurf: KAA, SMB, GSB Writing – Überprüfung und Redaktion: KAA, SMB, GSB

Korrespondenz mit Gurdyal S. Besra.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Junhao Zhu und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Abrahams, KA, Batt, SM, Gurcha, SS et al. DprE2 ist ein molekulares Ziel der antituberkulösen Nitroimidazol-Verbindungen Pretomanid und Delamanid. Nat Commun 14, 3828 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39300-z

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Eingegangen: 25. November 2022

Angenommen: 01. Juni 2023

Veröffentlicht: 28. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39300-z

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