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Jun 20, 2023

Entschlüsselung eines kryptischen Mechanismus der Metronidazol-Resistenz bei weltweit verbreiteten Fluorchinolonen

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4130 (2023) Diesen Artikel zitieren 1420 Zugriffe 19 Details zu Altmetric Metrics Schwere Ausbrüche und Todesfälle wurden mit der Entstehung und globalen Ausbreitung in Verbindung gebracht

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4130 (2023) Diesen Artikel zitieren

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19 Altmetrisch

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Schwere Ausbrüche und Todesfälle wurden in den letzten zwei Jahrzehnten mit dem Auftreten und der weltweiten Ausbreitung von Fluorchinolon-resistenten Clostridioides difficile in Verbindung gebracht. Gleichzeitig zeigte Metronidazol, ein nitrohaltiges Antibiotikum, eine abnehmende klinische Wirksamkeit bei der Behandlung von C. difficile-Infektionen (CDI). Die meisten Metronidazol-resistenten C. difficile weisen einen ungewöhnlichen Resistenzphänotyp auf, der nur in Empfindlichkeitstests mit molekular intaktem Häm nachgewiesen werden kann. Hier beschreiben wir den Mechanismus, der diesem Merkmal zugrunde liegt. Wir stellen fest, dass die meisten Metronidazol-resistenten C. difficile-Stämme eine T-zu-G-Mutation (die wir PnimBG nennen) im Promotor des Gens nimB tragen, was zu einer konstitutiven Transkription führt. Durch das Stummschalten oder Löschen von nimB wird die Metronidazol-Resistenz beseitigt. NimB ist mit Nim-Proteinen verwandt, von denen bekannt ist, dass sie Resistenz gegen Nitroimidazole verleihen. Wir zeigen, dass NimB ein Häm-abhängiges Flavinenzym ist, das Nitroimidazole zu Aminen abbaut, denen die antimikrobielle Aktivität fehlt. Darüber hinaus ist das Auftreten der PnimBG-Mutation mit einer Thr82Ile-Substitution in der DNA-Gyrase verbunden, die bei epidemischen Stämmen Fluorchinolonresistenz verleiht. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die in den letzten Jahrzehnten aufgetretene Pandemie von Fluorchinolon-resistenten C. difficile auch durch eine weit verbreitete Resistenz gegen Metronidazol gekennzeichnet war.

Die Clostridioides-difficile-Infektion (CDI), eine der Hauptursachen für krankenhausassoziierten Durchfall, hat internationale Aufmerksamkeit auf sich gezogen, da sich die klinischen Ergebnisse aufgrund der weltweiten Ausbreitung epidemischer Stämme des PCR-Ribotyps (RT) 0271,2,3 verschlechterten; RT027 gehört zur phylogenetischen Klade 2 (Ergänzende Daten 1 zeigen die Beziehung zwischen Ribotyp und phylogenetischen Klassifizierungen basierend auf Genomen von Stämmen; in dieser Studie werden Stämme basierend auf ihrem Ribotyp und/oder phylogenetischen Klade klassifiziert, sofern nicht anders angegeben)4,5. Diese Stämme verursachten CDI-Ausbrüche in Nordamerika, Großbritannien, Europa und Lateinamerika mit einem erhöhten Auftreten schwerer Erkrankungen, Morbidität und Mortalität1,2,6. Diese globalen Ausbrüche markieren auch die Pandemie-Ära von CDI3. Zu dieser Zeit waren Metronidazol und Vancomycin die beiden wichtigsten Antibiotika zur Behandlung von CDI, bis Fidaxomicin 2011 von der FDA zugelassen wurde. Aufgrund der nachlassenden Wirksamkeit wird Metronidazol in der aktualisierten Fassung jedoch nicht mehr als Mittel der ersten Wahl bei CDI bei Erwachsenen empfohlen IDSA/SHEA- und ESCMID-CDI-Richtlinien7,8. Dies stellt einen signifikanten Wandel im Behandlungsparadigma der CDI dar9,10,11,12, wobei Metronidazol als intravenöse Therapie in Kombination mit Vancomycin für die fulminante CDI reserviert ist7,8. Diese Veränderungen bei CDI-Therapeutika aufgrund der abnehmenden Wirksamkeit von Metronidazol rechtfertigen die Aufklärung der mikrobiellen genetischen Faktoren, die dieses Medikament und die globale CDI-Epidemiologie beeinflussen. Die mikrobiellen genetischen Determinanten der Metronidazol-Resistenz sind kaum bekannt.

Metronidazol wurde nach klinischen Studien in den 1980er und 1990er Jahren als Antibiotikum gegen CDI etabliert und zeigte dort nicht nur vergleichbare klinische Erfolgsraten wie Vancomycin, sondern war auch viel kostengünstiger13,14. Allerdings hat es in den letzten zwei Jahrzehnten im Vergleich zu Vancomycin an Wirksamkeit verloren15,16. Dies wurde ursprünglich in einer zwischen 1994 und 2002 durchgeführten randomisierten klinischen Studie beobachtet, in der Metronidazol eine Heilungsrate von 84 % zeigte, verglichen mit 97 % bei Vancomycin15. In einer zweiten klinischen Studie, die zwischen 2005 und 2007 durchgeführt wurde, zeigte Vancomycin bessere Heilungsraten als Metronidazol, nämlich 81,1 % im Vergleich zu 72,7 %16. Diese beiden Studien zeigen, dass Metronidazol im Zeitalter der Epidemie an Wirksamkeit verlor. Tatsächlich haben sich die Misserfolge bei Metronidazol-Behandlungen in Quebec mehr als verdoppelt, von 9,6 % in den Jahren 1991–2002 auf 25,7 % in den Jahren 2003–200417, der Region, in der auch der erste Ausbruch der Epidemie RT0272 gemeldet wurde. Die Gründe für den verringerten klinischen Nutzen von Metronidazol sind seit langem ein Rätsel. Eine Möglichkeit besteht darin, dass der verstärkte Einsatz von Metronidazol als Reaktion auf steigende CDI-Raten einen Selektionsdruck ausübte, der die Entstehung und Verbreitung arzneimittelresistenter C. difficile ermöglichte.

Metronidazol ist ein Nitroimidazol-Prodrug, das in Zellen durch Reaktionen von Oxidoreduktasen wie Pyruvat-Ferredoxin/Flavodoxin-Oxidoreduktase (PFOR) aktiviert wird, um reaktive Spezies (z. B. Anionen, Nitroso und Hydroxylamin-Zwischenprodukte) zu bilden, die DNA und Proteine ​​schädigen und abbauen zelluläre Thiole18. Metronidazol löst daher oxidativen/nitrosativen Stress bei C. difficile aus19. Interessanterweise sind klinische Isolate von C. difficile im Hinblick auf genetische Determinanten, die eine Resistenz gegen Metronidazol verleihen, nur unzureichend charakterisiert18,20. Kürzlich wurde berichtet, dass ein Plasmid mit hoher Kopienzahl (pCD-METRO) eine klinische Resistenz gegen Metronidazol in einem C. difficile-Isolat verleiht, das von einem Patienten erhalten wurde, bei dem die Metronidazol-Therapie versagte20. Allerdings kodiert die überwiegende Mehrheit der Metronidazol-resistenten C. difficile nicht für pCD-METRO20. Bei einer Untersuchung von 10.330 öffentlich zugänglichen Genomen wurde pCD-METRO in nur 15 Stämmen gefunden, was darauf hindeutet, dass es äußerst selten ist21. Weitere Komplexität ergab sich aus Berichten über Metronidazol-resistente C. difficile mit instabilen minimalen Hemmkonzentrationen (MHK). Dies hat wahrscheinlich zu einer systematischen Unterschätzung der Prävalenz von Metronidazol-resistentem C. difficile geführt. Kürzlich wurde gezeigt, dass Häm für den genauen Nachweis der Metronidazol-Resistenz bei C. difficile essentiell ist, und die Mehrzahl der Metronidazol-resistenten C. difficile weist über einen unbekannten Mechanismus eine Häm-abhängige Resistenz auf22,23; pCD-METRO verleiht keine Häm-abhängige Resistenz22. Aufgrund der Entdeckung des Häm-abhängigen Phänotyps kann nun der zugrunde liegende Mechanismus der Metronidazol-Resistenz, der zuvor als instabil galt, aufgeklärt werden.

Hier beschreiben wir die Entdeckung und genetische Validierung des Mechanismus der Häm-abhängigen Resistenz gegen Metronidazol und zeigen seinen Zusammenhang mit der globalen Übertragung des epidemischen C. difficile durch genomweite Assoziationsstudien und Populationsgenetik auf. Wir entdeckten, dass epidemische Stämme eine häufige Variante des regulatorischen Promotors der 5-Nitroimidazol-Reduktase (CDR20291_1308, annotiert als nimB) entwickelten, was zu dessen Umwandlung von einem kryptischen in ein konstitutiv exprimiertes Resistenzgen führte. Wir zeigen weiterhin, dass das Protein C. difficile NimB (CdNimB) ein Häm-bindendes Flavoenzym ist, das 5-Nitroimidazole bioreduktiv zu entsprechenden Aminen inaktiviert, und dass sein Substratprofil 4-Nitrobenzoesäure und 2-Nitroimidazol umfasst. Schließlich entdeckten wir eine starke Korrelation zwischen der nimB-Promotor-Variante und einer Thr82Ile-Mutation in der DNA-Gyrase A (GyrA), die Fluorchinolonresistenz verleiht und mit der weltweiten Ausbreitung des epidemischen C. difficile in Verbindung gebracht wird24,25,26. Diese gleichzeitig auftretenden Varianten sind stark mit epidemischen Stämmen verbunden, was darauf hindeutet, dass sie in diesem Umfeld von Vorteil sind. Daher aktualisieren diese Ergebnisse das aktuelle Paradigma für die schnelle globale Ausbreitung von Fluorchinolon-resistenten epidemischen C. difficile-Stämmen, die mit schlechten klinischen Ergebnissen verbunden sind24,25,26, was auch auf einen Zusammenhang mit einer Resistenz gegen Metronidazol hinweist.

Wir führten Metronidazol-Empfindlichkeitstests mit und ohne Häm an C. difficile-Stämmen verschiedener Ribotypen und Clades (Supplementary Data 1) aus den USA und Europa (n = 405) durch. Einundvierzig Prozent der Stämme zeigten einen ≥4-fachen Anstieg der Metronidazol-MICs in Gegenwart von Häm (MICs = 1–16 µg/ml) im Vergleich zu denen ohne Häm (MICs = 0,25–1 µg/ml). und dieses Kriterium wurde verwendet, um Stämme zu kennzeichnen, die eine Häm-abhängige Resistenz gegen Metronidazol aufweisen (Abb. 1a, Ergänzende Daten 1). Wir konnten keine Häm-unabhängigen Metronidazol-resistenten Isolate nachweisen. Im Gegensatz dazu zeigten Metronidazol-empfindliche Stämme einen zweifachen oder geringeren Unterschied in den MHKs, mit oder ohne Häm. Häm war auch für Stämme erforderlich, die MHK-Werte über dem EUCAST-Resistenz-Bruchpunkt von >2 μg/ml aufweisen; Ergänzende Abb. 1a, b).

a Die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) von MTZ wurden gegen globale klinische Isolate von C. difficile (n = 405) in Gegenwart und Abwesenheit von Häm bestimmt. Isolate mit Häm-abhängiger MTZ-Resistenz zeigten ≥4-fach höhere MHKs auf BHI-Agars, die Häm enthielten, im Vergleich zu Agars ohne Häm. Es wurde festgestellt, dass ein MTZ-MIC von 1 μg/ml (gestrichelte Linie) mit schlechten klinischen Ergebnissen verbunden ist58, obwohl der EUCAST-Resistenzgrenzwert bei 2 μg/ml liegt. Der Einschub zeigt ausgewählte epidemische und nicht epidemische RT027-Stämme, die gegenüber MTZ in Häm resistent bzw. anfällig sind. Nicht epidemisches RT027 wurde wie zuvor beschrieben definiert24 (d. h. fehlende Fluorchinolon-Resistenz-SNPs in Gyrase A und große Transposons, die im epidemischen RT027 gefunden wurden). Die MHKs stammten von zwei biologischen Replikaten mit zwei technischen Replikaten. Transkriptomreaktion von epidemischem R20291 (OD600 nm ≈ 0,2), das 30 Minuten lang MTZ (2 μg/ml) in Abwesenheit (b) und Anwesenheit (c) von Häm (5 μg/ml) ausgesetzt wurde. Die Vulkandiagramme zeigen unterschiedlich exprimierte Gene und ihre statistische Signifikanz; die violetten und grünen Punkte zeigen deutlich herunter- bzw. hochregulierte Gene an; Rot hervorgehobene Gene sind auf Zellstress reagierende und metabolische Gene, deren Expression durch MTZ verändert, aber durch Häm abgeschwächt wurde. Die RNA-Sequenz basiert auf zwei biologischen Replikaten, da das dritte Replikat in FastQC aufgrund schlechter Qualität abgelehnt wurde. Die Pearson-Korrelation von R2 = 0,94 in der ergänzenden Abbildung 2b zeigt, dass RNA-seq-Transkriptionsänderungen durch qPCR (drei biologische Replikate) validiert wurden. In (b) und (c) wurde die differenzielle Genexpression mit edgeR bestimmt, einem RNA-seq-Analysetool mit einer standardmäßigen statistischen Analyse der Falscherkennungsrate (FDR) ≤ 0,01 und einer auf ≥1 eingestellten Log2-Faltenänderung; Die ausgegebenen p-Werte für jedes Gen wurden in einen negativen Logarithmus (−Log10) umgewandelt und gegen die log2-fache Änderung im Graphpad-Prisma 9.4.1 aufgetragen. d Transkriptionelle Reaktion von epidemischem R20291 und nicht epidemischem CD196 auf MTZ (2 μg/ml) in Gegenwart von Häm (5 μg/ml). Die qPCR-Analyse der Transkriptionsmuster von Genen, die auf MTZ-Toxizität hinweisen, zeigt, dass Häm keinen Schutz für nicht epidemisches CD196 bietet. e Die Transkriptionsanalyse der Häm-empfindlichen/entgiftenden Gene hatT und hsmA in Häm mit oder ohne MTZ zeigt, dass sowohl CD196 als auch R20291 diese Gene stark exprimieren, wie durch qPCR bestimmt wurde. Die Daten aus (d) und (e) wurden im Graphpad-Prisma 9.4.1 durch einen zweiseitigen mehrfachen ungepaarten t-Test mit Korrektur für Mehrfachvergleiche unter Verwendung der Holm-Šídák-Methode und einem auf 0,05 eingestellten Alpha statistisch analysiert; Die Daten in jeder Parzelle stammten von drei biologischen Replikaten. f Häm-Sensor- und Entgiftungssysteme vermitteln keine Häm-abhängige MTZ-Resistenz. In R20291 hatte die Stummschaltung von hatT oder hsmA keinen Einfluss auf die Häm-abhängige Resistenz, was darauf hindeutet, dass diese Gene wahrscheinlich nicht zur Häm-abhängigen Resistenz beitragen; Antisense-RNA gegen hatT oder hsmA wurde in den Vektor pMSPT kloniert und durch 64 ng/ml Anhydrotetracyclin induziert; qPCR zeigte an, dass die hatT-mRNA um das ~7-fache (d. h. –7,21 ± 1,95) und die hsmA um das ~18-fache (d. h. –18,46 ± 10,66) abnahm. Die Daten in (d), (e) und (f) werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts dargestellt.

R20291, ein bekannter Modellstamm des epidemischen RT027 (Klade 2), der 2003–2006 bei einem Krankenhausausbruch in Stoke Mandeville, Großbritannien, isoliert wurde27, wurde als Hauptforschungsstamm übernommen, da er eine Häm-abhängige Resistenz gegen Metronidazol aufweist (MHK von 2). –4 μg/ml und 0,25–0,5 μg/ml, mit bzw. ohne Häm). Die Untersuchung der Transkriptionsreaktionen von R20291, die 30 Minuten lang Metronidazol (2 μg/ml) und Häm (5 μg/ml) ausgesetzt waren, zeigte, dass Häm die Hochregulierung von Signalwegen abschwächte, die mit der Metronidazol-Toxizität verbunden sind. Ohne Häm gab es 285 durch Metronidazol hochregulierte Gene (≥2-fach), aber nur 44 dieser Gene wurden hochreguliert, wenn Häm vorhanden war (Abb. 1b, c). Zu den Signalwegen, die durch die Toxizität von Metronidazol induziert werden und durch Häm gemildert wurden, gehören DNA-Replikation und -Reparatur (z. B. Ribonukleotidreduktase, nrdF) und auf Stress reagierende Chaperone (z. B. Co-Chaperonin, groES und bakterielles Hsp70-Chaperon, dnaK). Häm allein beeinflusste das C. difficile-Transkriptom nur minimal (ergänzende Abbildung 2a). Die Validierung der Gesamtqualität der RNA-seq-Daten durch qRT-PCR zeigte eine hohe Korrelation von R2 = 0,94 zwischen beiden Datensätzen (ergänzende Abbildung 2b, c). Als nächstes testeten wir, ob Häm auch die Metronidazol-Toxizität in Metronidazol-empfindlichem C. difficile CD196 (einem präepidemischen RT027-Stamm, der 1985 in Paris isoliert wurde) unterdrücken kann. Häm schwächte jedoch nicht die Genexpression ab, die mit der Metronidazol-Toxizität in CD196 verbunden ist (Abb. 1d, ergänzende Abb. 2d, e). Es wurde postuliert, dass der Häm-bindende Transkriptionsregulator HsmA28 mit der Häm-abhängigen Metronidazol-Resistenz verbunden sein könnte, da das Gen in RT010-Stämmen inaktiviert zu sein scheint22. Wir fanden jedoch keine Hinweise auf eine Beteiligung von HsmA oder des von hatRT29 kodierten Häm-Entgiftungssystems an der Vermittlung der Häm-abhängigen Metronidazol-Resistenz (Abb. 1e, f). Insgesamt deuten die Daten darauf hin, dass andere genetische Faktoren die Häm-abhängige Metronidazol-Resistenz vermitteln. Die rohen RNA-Seq-Daten sind in der NCBI-Datenbank unter der Zugangsnummer PRJNA880780 hinterlegt.

Um den genetischen Verlust der Häm-abhängigen Metronidazol-Resistenz zu untersuchen, haben wir in R20291 ~7488 Transposon (Tn)-Mutanten erzeugt, indem wir den Vektor pRPF-215 verwendet haben, der ein ATc-induzierbares Himar130 trägt. Dadurch wurden zwei Tn-Mutanten identifiziert, die im Vergleich zum Wildtyp (MHK von 4 µg/ml) achtmal empfindlicher gegenüber Metronidazol waren (MHK von 0,5 µg/ml). Die Genomsequenzierung ergab, dass die beiden Tn-Mutanten jeweils einzelne Insertionen in CDR20291_1308 oder CDR20291_2676 an den Positionen 1547478 (CDS-Position 464 von 468 nt) bzw. 3152802 (CDS-Position 1151 von 2412 nt) im R20291-Genom (FN545816.1) aufwiesen. Die beiden Gene werden als 5-Nitroimidazolreduktase (nimB) bzw. Cysteinprotease (cwp84) bezeichnet. Cwp84 ist für die Spaltung des Proteinvorläufers SlpA in der Oberflächenschicht (S-Schicht) in Untereinheiten mit niedrigem und hohem Molekulargewicht verantwortlich, die die parakristalline S-Schicht bilden. Obwohl cwp84 ein nicht-essentielles Gen ist, weisen Deletionsmutanten langsamere Wachstumsraten auf, was zu pleiotropen Effekten führen könnte, die die Metronidazol-Empfindlichkeit der cwp84-Tn-Mutante erhöhen31. C. difficile NimB (CdNimB) gehört zur Pyridoxamin-5′-phosphatoxidase-Proteinfamilie und ist mit dem NimA-Protein von Terrisporobacter spp. verwandt. WP_228108130.1 (60 % Identität) und NimB aus Bacteroides fragilis WP_063854490.1 (45 % Identität); Bemerkenswert ist, dass es mehrere Isoformen von Nim-Proteinen gibt (z. B. NimA-L), die chromosomal oder plasmidkodiert sein können32,33,34. Es wird angenommen, dass Nim-Proteine ​​eine Resistenz gegen Nitroimidazole verursachen, indem sie ihre Nitrogruppen schnell in antimikrobielle inaktive Aminoimidazol-Derivate umwandeln und so die Bildung reaktiver Spezies vermeiden35. Es ist jedoch unklar, inwieweit chromosomal kodiertes nimB bei C. difficile Resistenz gegen Metronidazol verleiht, da dieses Gen in dieser Art allgegenwärtig zu sein scheint und seine bloße Anwesenheit nicht direkt zu einer Resistenz führt. Dennoch haben wir uns aufgrund des ausgeprägten Phänotyps der Tn-Mutante (R20291-Tn::nimB) und der hohen Wahrscheinlichkeit, dass nimB in C. difficile ein weiterer kryptischer Resistenzmechanismus sein könnte, für eine weitere Untersuchung von nimB entschieden. Als wir daher durch Allelaustausch in R20291 eine NimB-Knockout-Mutante erzeugten, rekapitulierte die Mutante den Metronidazol-empfindlichen Phänotyp von R20291-Tn::nimB (d. h. MHK = 0,25 µg/ml für R20291ΔnimB vs. 4–8 µg/ml für der Wildtyp in Gegenwart von Häm, Abb. 2a). Bemerkenswert ist, dass R20291ΔnimB etwas anfälliger gegenüber Metronidazol war als R20291-Tn::nimB; Möglicherweise ist dies ein Ergebnis der ermB-Insertion direkt nach dem Codon für das C-terminale Arginin-154, sodass CdNimB von R20291-Tn::nimB möglicherweise eine gewisse Aktivität aufweist, wenn auch nicht ausreichend, um eine Resistenz gegen Wildtyp-Spiegel zu verursachen. Wichtig ist, dass die Häm-abhängige Resistenz nach der Komplementierung von R20291ΔnimB und R20291-Tn::nimB mit plasmidbasiertem Wildtyp-nimB von R20291 wiederhergestellt wurde (MICs = 4–8 µg/ml) (Abb. 2a).

Ein Screening einer Transposon (Tn)-Bibliothek ergab, dass die Insertionsinaktivierung von nimB die Resistenz in R20291 aufhob. Die allelische Deletion von nimB bestätigte dessen Rolle bei der Resistenz; In beiden Mutanten wurde die Resistenz durch Komplementierung mit Wildtyp-nimB, das von seinem nativen Promotor exprimiert wurde, wiederhergestellt. b Aufeinanderfolgende Isolate eines Patienten, bei dem die MTZ-Therapie versagte, wurden am Tag 1 (vor der Therapie) und am Tag 26 (nach Ende der Therapie) gesammelt; Das Isolat vom Tag 1 (23475, MHK = 0,25 μg/ml) und das Isolat vom Tag 26 (23468, MHK = 1,0 μg/ml) waren MTZ-empfindlich bzw. -resistent. In Enterobase zeigte die Multilocus-Sequenztypisierung des Kerngenoms, dass die beiden Isolate die gleiche hierarchische Clusterbildung (HC0) aufwiesen, was darauf hindeutet, dass sie identische Kerngenome haben oder sich zumindest nicht um mehr als zwei SNPs unterscheiden. cgMLST Ninja Neighbor Joining GrapeTree von C. difficile, der zu ST350 gehört; 23475 und 23468 im selben Knoten geclustert. Der Maßstabsbalken zeigt die Anzahl der Allelunterschiede an. c Die Sanger-Sequenzierung zeigte, dass 23468 im Vergleich zu 23475 eine T-zu-G-Mutation im −10-nimB-Promotor aufweist, was einen Vergleich des gesamten Genoms bestätigt; Die Sanger-Sequenzierung wurde an einer Kolonie durchgeführt, die von der für die Genomsequenzierung verwendeten Kolonie getrennt war (dh n = 1 pro Stamm). Diese Mutation wird in 23468 als PnimBG bezeichnet, während der Wildtyp in 23475 als PnimBT bezeichnet wird. d qPCR-Analyse der NimB-Transkription in resistenten und anfälligen Stämmen, die PnimBG bzw. PnimBT tragen. Resistente Stämme (23468, R20291 und 70/76) wiesen höhere Mengen an nimB-mRNA auf als anfällige Stämme (23475 und CD196); Die nimB-Transkription war in resistenten Stämmen konstitutiv. Stämme wurden unter verschiedenen Bedingungen kultiviert (MTZ [2 μg/ml] und Häm [5 μg/ml]); Dargestellt sind fache mRNA-Mengen in resistenten Stämmen im Vergleich zu anfälligen Stämmen. e Zusammenhang zwischen Resistenz und NimB-Variationen zwischen nicht epidemischem CD196 und epidemischem R20291. Die NimBs von CD196 und R20291 wurden von ihren nativen Promotoren in den angegebenen Stämmen exprimiert. f Vergleich der Promotorstärken von PnimBG und PnimBT basierend auf der Transkription und Fluoreszenz von mCherryOpt. Die Fluoreszenz wurde auf eine Kulturdichte von OD600 nm normalisiert. PnimBG war mit einer konstitutiven Expression verbunden, was sich in einer höheren Fluoreszenz widerspiegelte. Die genetische Stummschaltung von nimB kehrt die Resistenz um. nimB wurde durch eine Antisense-RNA (asRNA) (g) und durch CRISPR-Interferenz mit zwei Guide-RNAs (gRNAs) (h) zum Schweigen gebracht. AsRNA wurde durch Anhydrotetracyclin (64 ng/ml) vom Ptet-Promotor im Vektor pMSPT induziert, während gRNA durch Xylose (1 % w/v) vom Pxyl-Promotor im Vektor pXWxyl-dcas9 induziert wurde. Die Daten in (a), (d), (e), (f), (g) und (h) werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts aus drei biologischen Replikaten angezeigt.

Um genetische Mechanismen in klinischen Stämmen zu identifizieren, sequenzierten wir ein Paar Isolate, die von einem einzelnen Patienten vor und nach der Therapie mit Metronidazol erhalten wurden. Diese Isolate stammten aus den klinischen MODIFY-Studien mit Bezlotoxumab37. Das Metronidazol-empfindliche Isolat (23475, RT014) wurde bei der Basisdiagnose gewonnen und hatte eine MHK von 0,25 µg/ml, während das zweite Isolat (23468, RT014), das nach der Metronidazol-Therapie (Tag 26 nach der Diagnose) erhalten wurde, eine MHK von 1 µg aufwies /ml (es wurden keine weiteren Patienteninformationen offengelegt). Um die genetische Verwandtschaft zu beurteilen, wurden die Genome von 23475 und 23468 durch Core-Genom-Multilocus-Sequenztypisierung (cgMLST) in EnteroBase analysiert. Dies ergab, dass sie einen einzigartigen hierarchischen HC0-Cluster bildeten, der auf einen nicht unterscheidbaren Kerngenom-Sequenztyp hinweist (beide waren). bezeichnet als cgMLST 20612; Abb. 2b). Genomausrichtung und Sanger-Sequenzierung ergaben, dass der resistente Stamm 23468 einen Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP) von T zu G in der vorhergesagten −10 regulatorischen Promotorregion (dh TTCTAAAAT zu TGCTAAAAT) entwickelte (Abb. 2c). Die SNP-Unterschiede wurden als PnimBT und PnimBG für den anfälligen Wildtyp bzw. den resistenten Mutanten bezeichnet. Da die −10-Region die RNA-Polymeraseaktivität beeinflusst38,39, haben wir getestet, ob der SNP die nimB-Transkription beeinflusst. qRT-PCR ergab, dass 23468 im Vergleich zu 23475 durchschnittlich 16- bis 40-fach größere Mengen an NimB-Transkripten aufwies (Abb. 2d). Die erhöhte nimB-Transkription in 23468 hing nicht von Häm oder der Anwesenheit von Metronidazol ab, was darauf hindeutet, dass das Gen konstitutiv transkribiert wurde. Interessanterweise zeigten 23468 und 23475 vergleichbare Wachstumsraten bei BHI mit oder ohne Häm, was darauf hindeutet, dass die konstitutive Expression von nimB keinen Einfluss auf die Fitness hatte (ergänzende Abbildung 3).

Die konstitutive Transkription könnte auch erklären, warum in unserer RNA-Sequenz keine unterschiedliche Expression von nimB beobachtet wurde. Als nächstes verglichen wir die regulatorischen Regionen von nimB im präepidemischen CD196 (anfällig) mit dem epidemischen R20291 (resistent). Dies ergab, dass CD196 für PnimBT kodierte, wohingegen R20291 für PnimBG kodierte, was darauf hindeutet, dass die Entwicklung eines SNP in der regulatorischen Region von nimB eine Metronidazol-Resistenz hervorrief. Wir verglichen daher die nimB-mRNA-Spiegel in verschiedenen Metronidazol-empfindlichen Stämmen (z. B. CD196 und CD630 mit PnimBT) und resistenten Stämmen (z. B. R20291 und 70/76 mit PnimBG). R20291 wies im Vergleich zu den anfälligen Stämmen (CD196 und CD630) eine etwa 39 ± 1- bis 94 ± 17-fach oder 81 ± 5- bis 203 ± 100-fach höhere nimB-mRNA auf, mit oder ohne Häm oder Metronidazol (Abb. 2d, Ergänzung). Abb. 4a). Der resistente Stamm 70/76 wies im Vergleich zu anfälligen Stämmen auch größere Mengen an nimB-mRNA auf (Abb. 2d, ergänzende Abb. 4a). Insgesamt wiesen alle resistenten Stämme niedrigere CT-Werte auf, was auf eine erhöhte nimB-mRNA im Vergleich zu anfälligen Stämmen hinweist (ergänzende Abbildung 4b).

Die Genexpression von PnimBT und PnimBG wurde auf verschiedene Weise untersucht, um festzustellen, warum sich die NimB-mRNA-Spiegel unterscheiden. Erstens wurde nimB von CD196 oder R20291 unter ihren zugehörigen Promotoren in anfälligem CD196 und R20291-Tn::nimB ektopisch exprimiert. In anfälligen Hintergründen verlieh die PnimBT-nimB-Sequenz von CD196 niedrigere MHK-Werte (1–2 μg/ml) als PnimBG von R20291 (MHK-Werte von 4–8 μg/ml) (Abb. 2e). Zweitens untersuchten wir die Auswirkung dieses Unterschieds, indem wir beide Gene unter dem Tetracyclin-induzierbaren Promotor (Ptet) exprimierten, da sich NimB von CD196 und R20291 durch einen einzelnen Leu155Ile-Polymorphismus unterscheiden. Unter Ptet verliehen beide Polymorphismen eine äquivalente Häm-abhängige Resistenz in R20291-Tn::nimB (ergänzende Abbildung 4c), was einer früheren Hypothese widerspricht, dass Leu155Ile die Metronidazol-Resistenz beeinflusst . Drittens haben wir den mCherryOpt-Reporter41 verwendet, um die Promotorstärken von PnimBT und PnimBG in verschiedenen genetischen Hintergründen unter drogenfreien und Metronidazol-Bedingungen zu vergleichen. Wie in Abb. 2f gezeigt, hatte CD196, das PnimBG::mCherryOpt exprimierte, eine höhere Fluoreszenz (6943 ± 1729 bis 8437 ± 1308 RFU) im Vergleich zu PnimBT::mCherryOpt (290 ± 43 bis 335 ± 26 RFU). In ähnlicher Weise zeigte R20291, das PnimBG::mCherryOpt exprimierte, eine höhere Fluoreszenz als PnimBT::mCherryOpt (6354 ± 454 bis 7219 ± 56 RFU bzw. 423 ± 38 bis 527 ± 20 RFU). Diese Trends stimmten mit anderen getesteten anfälligen und resistenten Stämmen überein, d. qPCR bestätigte, dass die höhere mCherry-Fluoreszenz von PnimBG im Vergleich zu PnimBT größeren Mengen an mCherry-mRNA entsprach (ergänzende Abbildung 4f). Viertens: Da nimB konstitutiv unter PnimBG transkribiert wird, gingen wir davon aus, dass eine genetische Stummschaltung die Anfälligkeit für Metronidazol wiederherstellen würde. Daher haben wir nimB mit zwei verschiedenen Methoden42 zum Schweigen gebracht: mit dem Vektor pMSPT, der vermutlich die mRNA-Translation durch Antisense-RNA (asRNA), die auf die UTR-Region abzielt, blockiert, oder durch Crispr-Interferenz, um die Transkription mit einer Leit-RNA (gRNA) zu nimB zu blockieren, das vom Vektor pXWxyl exprimiert wird -dcas942. Die Expression von asRNA gegen nimB aus pMSPT kehrte die Häm-abhängige Resistenz in R20291 und anderen getesteten RT027-Stämmen im Vergleich zum leeren Vektor oder den nicht induzierten Kontrollen um (Abb. 2g). Die Stummschaltung von nimB mit gRNA erhöhte auch die Anfälligkeit dieser Stämme gegenüber Metronidazol im Vergleich zum leeren Vektor oder zu nicht induzierten Kontrollen (Abb. 2h). Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die Häm-abhängige Metronidazol-Resistenz eine konstitutive Transkription von nimB beinhaltet, die durch den stärkeren Promotor PnimBG gesteuert wird.

Als nächstes enthüllten wir, dass NimB ein Hämoprotein ist, was erklärt, warum Häm für die Metronidazol-Resistenz erforderlich ist. Es gibt keine Berichte darüber, dass Nim-Proteine ​​Häm binden. Laut Phyre2 war CdNimB jedoch strukturell mit den Häm-bindenden Flavocytochromen Anf3-Nitrogenase aus Azotobacter vinelandii (PDB-ID 6RK0) und den Flavin/Deazaflavin-Oxidoreduktasen MSMEG_4975 aus Mycobacterium smegmatis (PDB-ID 4YBN) verwandt43,44. Anf3 und MSMEG_4975 sind Proteine ​​der Pyridoxamin-5′-Phosphatoxidase-Familie, die Häm über das strukturell homologe proximale Histidin-70 bzw. Histidin-62 binden43,44. Um das/die Häm-Bindungsmotiv(e) in NimB-Proteinen zu entdecken, haben wir zunächst die B. thetaiotaomicron NimB-Kristallstruktur (PDB ID 2FG9) mit der von Anf3 abgeglichen und dabei festgestellt, dass BtNimB-Histidin-50 homolog zu Anf3-Histidin-70 war (ergänzende Abb. 5). In ähnlicher Weise zeigten Sequenzausrichtung und strukturelle Homologiemodellierung, dass Histidin-55 von CdNimB homolog zu Anf3-Histidin-70 war (Abb. 3a, b). Interessanterweise ist die Aminosäure auch mit Histidin-71 in Deinococcus radiodurans (DrNimA, Q9RW27; Abb. 3a) identisch, von dem angenommen wurde, dass es einen nicht identifizierten Cofaktor bindet, der die Farbe des Enzyms in Suspension beeinflusst45. Hemoquest46, ein Algorithmus, der Häm-bindende Motive vorhersagt, identifizierte auch CdNimB-Histidin-55 als möglichen Häm-bindenden Rest, zusammen mit Cystein-56, Histidin-61, Cystein-101 und Tyrosin-119. Um den entscheidenden Rest zu definieren, wurden daher NimB-Varianten (His55Ala, Cys56Ala, His61Ala und Tyr119Ala) durch ortsspezifische Mutagenese erzeugt, in anfälligem R20291-Tn::nimB exprimiert und auf Resistenzverlust getestet. Die Ala-55-Mutante war die einzige Variante, die keine Häm-abhängige Resistenz verursachte (Abb. 3c, ergänzende Abb. 6a).

a Sequenzvergleich von Nim-Proteinen aus C. difficile und anderen Bakterien mit der strukturell verwandten Häm-bindenden Flavocytochrom-Anf3-Nitrogenase aus Azotobacter vinelandii (AvAnf3, Zugangsnummer 6RK0). Histidin-70 (rotes Sternchen) ist der proximale Häm-bindende Ligand von Anf3 und eine konservierte Aminosäure in Nim-Proteinen, z. B. Histidin-55 in CdNimB. Andere Sequenzen und Zugangsnummern stammen von: Tp, Terrisporobacter Petrolearius WP_228108130 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/2129663836); Bf, Bacterioides fragilis WP_063854490.1; Bh, Brachyspira hampsonii WP_039955657; Dr. Deinococcus radiodurans Q9RW27; und Pb, Prevotella baroniae ACR40098.1. b Strukturelle Ausrichtung mit Anf3 (grüne Kugel und Stab), ein CdNimB-Homologiemodell (violette Bänder) zeigt große strukturelle Ähnlichkeit. Das CdNimB-Modell wurde aus der an FAD gebundenen NimB-Röntgenstruktur von B. thetaiotaomicron (PDB ID 2FG9) generiert und mit Anf3 ausgerichtet, an das sowohl FAD als auch Häm gebunden sind (siehe ergänzende Abbildung 5). Das Modell zeigt, dass CdNimB Histidin-55 (lila) strukturell äquivalent zu Histidin-70 (grün) von Anf3 ist; Die FAD-Domänen sind auch in den beiden Proteinen konserviert. FAD und Häm von Anf3 werden als Kugel/Stab mit grünen Kohlenstoffatomen dargestellt; der FAD von CdNimB wird als Kugel/Stab mit violetten Kohlenstoffatomen dargestellt; Der Einfachheit halber ist nur Histidin-70 des Anf3-Proteins dargestellt. c Durch Alanin-Mutagenese wurde festgestellt, dass Histidin-55 eine Häm-abhängige Metronidazol-Resistenz (MTZ) vermittelt. Unter den verschiedenen Alaninmutanten zeigte nur die His55Ala-Mutante keine Resistenz, wenn sie in R20291-Tn::nimB exprimiert wurde; Die NimB-Varianten wurden in pRPF185 unter PnimBG exprimiert. Absorptionsspektren zeigen, dass Wildtyp-CdNimB (d) Häm bindet, dieses jedoch in der His55Ala-CdNimB-Mutante (e) abgeschwächt ist. Die Spektren wurden durch Zugabe zunehmender Konzentrationen von Häm (dh Hämin, 1–7 µM) zu 10 µM Protein erhalten (die Daten sind repräsentativ für drei experimentelle Replikate). Häm wurde titriert, bis die Sättigung erreicht war, wobei es zu keinen weiteren signifikanten Änderungen der Absorptionswerte kam. Der Puffer wurde auf ähnliche Weise mit Häm titriert und die Werte von den Proteinspektraldaten abgezogen. Die Einschübe zeigen Bindungssättigungskurven basierend auf der Änderung der Absorption bei 416 nm als Funktion der Hämkonzentration. f Vergleich der Nitroreduktaseaktivitäten von Wildtyp-CdNimB und Ala-55-Mutante. Die Reduktion verschiedener Nitroaromaten wurde in einer Reaktion getestet, die CdNimB (10 μM), Häm (10 μM), FAD (10 μM) und NADPH (3 mM) enthielt. Die Reaktionen wurden 2 Stunden lang inkubiert und die Bildung aromatischer Amine mithilfe des Bratton-Marshall-Assays nachgewiesen; Imidazol, Natriumbenzoat und Vancomycin waren nicht nitroaromatische Negativkontrollen. Die entsprechende Assay-Entwicklung ist in der ergänzenden Abbildung 8 dargestellt. Die Daten wurden im Graphpad-Prisma 9.4.1 durch einen zweiseitigen mehrfachen ungepaarten t-Test mit Korrektur für Mehrfachvergleiche unter Verwendung der Holm-Šídák-Methode und einem auf 0,05 eingestellten Alpha statistisch analysiert. Vergleich der Nitroreduktaseaktivitäten der Wildtyp-CdNimB- und His55Ala-Mutante mit Quantifizierung mithilfe des Bratton-Marshall-Assays. Wie in (g) gezeigt, wird in (h) 4-Nitrobenzoesäure zu 4-Aminobenzoesäure und 2-Nitroimidazol zu 2-Aminoimidazol reduziert. i LC-MS/MS-Quantifizierung von 2-Aminoimidazol, das aus der Reduktion von 2-Nitroimidazol in Nitroreduktase-Assays mit Wildtyp- oder His55Ala-CdNimBs entsteht. Es gibt Unterschiede in den relativen Mengen an 2-Aminoimidazol, die mit den LC-MS/MS- und Bratton-Marshall-Methoden quantifiziert wurden, aber die Ergebnisse beider Methoden kamen zu dem gleichen Schluss, dass die Mutante bei der Bildung des Aminprodukts weniger wirksam ist. j Zelluläre Reduktion von 2-Nitroimidazol zu 2-Aminoimidazol. Konzentrierte Kulturen verschiedener isogener Stämme wurden mit 2-Nitroimidazol (2 mM) allein oder mit Häm behandelt und 3 Stunden lang inkubiert, bevor 2-Aminoimidazol quantifiziert wurde. Die Diagramme zeigen den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts aus vier Replikaten, mit Ausnahme von drei biologischen Replikaten für R20291ΔnimB comp.PnimB. Statistische Analysen in (g)–(j) wurden durch einen zweiseitigen ungepaarten t-Test im Graphpad-Prisma 9.4.1 durchgeführt. Die Daten in (c), (f)–(i) stammen aus drei biologischen Replikaten. Die Daten in (d) und (e) zeigen eines von drei getesteten biologischen Replikaten; Die anderen beiden Replikate verhielten sich wie in (d) und (e) gezeigt.

Spektrophotometrische Analysen der Soret-Bande, die die Häm-Bindung an Proteine ​​anzeigt, zeigten, dass rekombinantes Wildtyp-CdNimB aus R20291 bei der Häm-Bindung fast doppelt so effektiv war wie die Ala-55-Mutante. Die Inkubation von Wildtyp-CdNimB (10 μM) mit zunehmenden Mengen Häm (1–7 μM) erzeugte eine Soret-Bande bei 416 nm (Abb. 3d), was die Entwicklung eines Häm-Protein-Komplexes bestätigte. Zunehmende Hämkonzentrationen führten zu einer höheren Peakintensität und erreichten eine Sättigung bei ≥4 μM Häm (Abb. 3d). Im Gegensatz dazu zeigte äquimolares NimB-Ala-55 mindestens 50 % geringere Soret-Bandenintensitäten (Abb. 3e), was auf eine verringerte Bildung des Protein-Häm-Komplexes hinweist. Dies wurde visuell bestätigt, da Enzym-Häm-Suspensionen aus den Wildtyp-CdNimB-Häm-Suspensionen eine intensivere rotbraune Farbe aufwiesen, was auf eine Häm-Protein-Komplexierung hinweist (ergänzende Abbildung 7a). In Anbetracht der Tatsache, dass 10 μM CdNimB mit 4 μM Häm gesättigt waren, was weniger als die Proteinkonzentration ist, schlussfolgerten wir, dass ein kleiner Teil des Proteins zelluläres Häm enthielt; tatsächlich wird ein Teil der in E. coli BL21(DE3) exprimierten Hämoproteine ​​im Holozustand gereinigt47. Mithilfe eines kolorimetrischen Peroxidase-Assays zum Nachweis niedriger Hämkonzentrationen (dh basierend auf Hämin) stellten wir fest, dass der Wildtyp CdNimB schätzungsweise 1,4–1,7-fach mehr Häm enthielt als die Ala-55-Mutante (ergänzende Abbildung 7b). Somit scheint Wildtyp-CdNimB in einer intrazellulären Umgebung Häm leichter zu binden als die Ala-55-Mutante. Interessanterweise wurde früher angenommen, dass Pyruvat ein Cofaktor für DrNimA48 ist. Dies wurde jedoch später in einer Studie45 widerlegt, in der berichtet wurde, dass das gereinigte DrNimA eine Soret-Bande aufwies, die in seiner verwandten His-71-Mutante (homolog zu His-55 in CdNimB) fehlte. Abb. 3a)45; Dies steht im Einklang mit unseren Erkenntnissen, dass CdNimB Häm bindet und eine Soret-Bande zeigt, die in der His-55-Mutante reduziert ist. Zusammengenommen ist CdNimB ein Häm-bindendes Protein, wobei Histidin-55 höchstwahrscheinlich als proximaler Ligand fungiert, eine Eigenschaft, die voraussichtlich auch in anderen Nim-Proteinen erhalten bleibt.

Es wird angenommen, dass Nim-Proteine ​​mechanistisch die Nitrogruppe von 5-Nitroimidazolen zu ihren ungiftigen Aminoderivaten reduzieren, nachdem Elektronen direkt von unbekannten Cofaktoren übertragen wurden35,45,49. Zur Unterstützung der Inaktivierung von Nitroimidazolen durch Nim wurde berichtet, dass B. fragilis-Zellen, die NimA tragen, Dimetridazol in Wilkins-Chalgren-Medium, das Häm enthält, zu Aminoderivaten reduzierten35. Um die Nitroreduktaseaktivität von CdNimB unter anaeroben Bedingungen zu testen, haben wir einen Nitroreduktasetest43 angepasst, bei dem die Oxidation von NADPH (Elektronendonor) mit der Reduktion von FAD und Häm gekoppelt ist. Das für primäre aromatische Amine spezifische Bratton-Marshall-Reagenz wurde verwendet, um das aromatische Aminoprodukt unter anaeroben Bedingungen kolorimetrisch nachzuweisen. Experimente mit Wildtyp-CdNimB zeigten, dass seine Nitroreduktaseaktivität von NADPH und einem nitroaromatischen Substrat (dh 4-Nitrobenzoesäure, 2-Nitroimidazol, Metronidazol) abhängt; ergänzende Abbildung 8a, b). Die Zugabe von nur NADPH und Nitrobenzoesäure führte zu enzymatischer Aktivität (ergänzende Abbildung 8b), da das Protein endogene Häm- und Flavin(s)-Cofaktoren enthält, die während der Expression des Proteins in E. coli nativ gebunden wurden (ergänzende Abbildung 7a– C). Leider waren Versuche, Häm mit Methylethylketon50 zu entfernen, erfolglos, da das Enzym ausfiel (Daten nicht gezeigt). Dennoch erhöhte die Zugabe von Häm (10 μM) und/oder FAD (10 μM) die enzymatische Aktivität deutlich (ergänzende Abbildung 8b), was die Rolle dieser Cofaktoren bei der Reduzierung der Nitrogruppe unterstützt. Anschließend verglichen wir die Aktivitäten von Wildtyp-CdNimB und der Ala-55-CdNimB-Mutante unter Verwendung verschiedener Substrate (4-Nitrobenzoesäure, Metronidazol, Dimetridazol und 2-Nitroimidazol) mit dem Bratton-Marshall-Nachweis aromatischer Amine. Bei allen Substraten zeigte Wildtyp-CdNimB eine signifikant höhere enzymatische Aktivität als die Ala-55-CdNimB-Mutante (Abb. 3f).

Um die Aminoreaktionsendprodukte der enzymatischen und zellulären Nitroreduktaseaktivitäten von CdNimB zu quantifizieren, haben wir das verwandte 2-Nitromidazol verwendet, da von 5-Nitroimidazolen abgeleitete 5-Aminoimidazole (z. B. Metronidazol) chemisch instabil sind51,52, was eine Quantifizierung durch LC schwierig machen würde -MS/MS. Im Gegensatz dazu produziert 2-Nitroimidazol stabilere 2-Aminoimidazole52 und ist auch ein Substrat für CdNimB (Abb. 3f); Nitrobenzoesäure hatte keine antimikrobielle Aktivität gegen C. difficile-Zellen. C. difficile zeigte auch eine Häm-abhängige Resistenz gegen 2-Nitroimidazol, d. h. in Abwesenheit von Häm betrugen die MHKs 0,25–1, 0,25–0,5 und 0,25–1 µg/ml gegen empfindliches CD196, R20291ΔnimB und R20291-Tn:: nimB (Ergänzende Abbildung 6b). Die Komplementierung mit Wildtyp-nimB aus R20291 verlieh Resistenz gegen 2-Nitroimidazol in Gegenwart von Häm (MHK-Werte von 4–8 μg/ml), aber die Komplementierung mit der Ala-55-Variante stellte die Resistenz gegenüber Wildtyp-Werten nicht wieder her (MHK-Werte von 0,25–2 μg). /ml; Ergänzende Abb. 6b). In Nitroreduktase-Enzymtests war NimB-Ala-55 weniger wirksam bei der Reduzierung von 4-Nitrobenzoesäure und 2-Nitroimidazol (unter Verwendung des Bratton-Marshall-Tests, Abb. 3g, h). Die LC-MS/MS-Analyse bestätigte, dass 2-Nitroimidazol durch Wildtyp-CdNimB in 2-Aminoimidazol umgewandelt wurde, wohingegen die NimB-His55Ala-Variante deutlich weniger Aminoprodukt herstellte (Abb. 3i). Als nächstes untersuchten wir die zelluläre Reduktion von 2-Nitroimidazol unter Verwendung isogener Stämme von R20291 (mit einer leeren Vektorkontrolle, R20291ΔnimB und R20291ΔnimB::nimB-Komplementierung) und CD196 (mit einer leeren Vektorkontrolle oder ektopisch exprimierendem NimB aus PnimBG). In Abwesenheit von Häm produzierten sowohl anfällige als auch resistente Stämme nahezu gleiche, aber geringe Mengen an 2-Aminoimidazol (~419 ± 48 bis 542 ± 24 μM), gemessen durch LC-MS/MS. Die Zugabe von Häm erhöhte die Produktion von 2-Aminoimidazol um ~60,9–77,8 % (d. h. ~1386 ± 201 bis 1890 ± 340 μM), jedoch nur bei den resistenten Stämmen (Abb. 3j). Darüber hinaus zeigte der mit Wildtyp-nimB ergänzte Stamm, wenn isogene Stämme von R20291-Tn::nimB mit 2-Nitroimidazol und Häm behandelt wurden, eine um 25,4–29,0 % höhere Aminoimidazolproduktion als Stämme, die mit der Ala-55-Codon-Variation oder dem leeren Vektor ergänzt wurden ( Ergänzende Abbildung 9). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass CdNimB eine Nitroreduktase ist, die Nitroimidazole sowohl enzymatisch als auch zellulär in Häm-abhängiger Weise in ihre Aminoderivate umwandelt.

Da die obigen Beobachtungen dazu beitragen könnten, eine langjährige Debatte darüber zu klären, ob Nim-Gene Metronidazol-Resistenz verleihen53, haben wir getestet, ob NimA aus B. fragilis auch Häm-abhängige Resistenz verleiht. Daher erzeugte Codon-optimiertes B. fragilis-nimA (OCL16839.1) eine Häm-abhängige Resistenz, wenn es in Metronidazol-empfindlichem C. difficile CD630 und R20291ΔnimB exprimiert wurde, oder es erhöhte die Resistenz in R20291 (ergänzende Abbildung 10a). In ähnlicher Weise zeigte die Beurteilung des nimA-Referenzstamms B. fragilis 638 R/pIP417(nimA)54, dass dieser eine Häm-abhängige Resistenz gegen Metronidazol aufwies (MHK-Werte von 0,5–1 μg/ml und 4–8 μg/ml, ohne und mit Häm). bzw. ergänzende Abb. 10b). Wir spekulieren daher, dass Nim-Gene in anderen Organismen, wie nimB aus C. difficile, kryptisch sein könnten und ihre Resistenzphänotypen durch die zelluläre Regulierung von Nim und die intrazelluläre Verfügbarkeit von Cofaktoren (z. B. Häm und möglicherweise Flavin) bestimmt werden könnten.

Da die Häm-abhängige Metronidazol-Resistenz der dominierende Phänotyp von Metronidazol-resistentem C. difficile zu sein scheint, haben wir beschlossen, die potenziellen Mechanismen, die diesem Phänotyp zugrunde liegen, mit genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) geografisch unterschiedlicher natürlicher Bakterienpopulationen weiter zu untersuchen. Wir haben diese Analysen an einem Datensatz von 348 klinischen Isolaten durchgeführt, für die wir die MHK von Metronidazol in Gegenwart und Abwesenheit von Häm bestimmt haben. Wir haben zwei Methoden verwendet, um genetische Varianten zu identifizieren, die mit der Häm-abhängigen Metronidazol-Resistenz verbunden sind: die FST-Ausreißeranalyse55, die Allele mit deutlichen Häufigkeitsschwankungen zwischen Subpopulationen identifiziert, und PySeer, das lineare Modelle mit festen oder gemischten Effekten verwendet, um die Folgen abzuschätzen genetische Variation in einer Bakterienpopulation eines interessierenden Phänotyps56.

Beide Methoden identifizierten zwei SNPs als extreme Ausreißer in ihrem Zusammenhang mit der Metronidazolresistenz (Abb. 4a, ergänzende Abb. 11). Die nimB-Promotor-Mutation war einer dieser SNPs und überraschenderweise war die andere mit Resistenz verbundene Variante eine Mutation 245C>T in gyrA (Thr82Ile in Gyrase A), die Resistenz gegen Fluorchinolone verleiht. Die Thr82Ile-Mutation wurde mit der pandemischen Ausbreitung von C. difficile im Zusammenhang mit dem Gesundheitswesen in Verbindung gebracht24. Es gibt keine bekannte mechanistische Grundlage für einen Zusammenhang zwischen GyrA und Metronidazol-Resistenz. Stattdessen nehmen wir an, dass Thr82Ile in GyrA und der NimB-Promotor SNP beide einer positiven Richtungsselektion unterliegen und dass ihre Kombination die pandemische Ausbreitung von C. difficile hätte ermöglichen können. Um diese Hypothese zu testen, untersuchten wir zunächst die Genomdaten auf Anzeichen einer Selektion, indem wir Homoplasien identifizierten: Varianten, die unabhängig voneinander mehr als einmal in der Phylogenie auftreten und ein potenzielles Signal für eine positive Selektion darstellen55. Mithilfe der Ahnenrekonstruktion haben wir geschätzt, dass die gyrA-Mutation in unserer Stichprobe von 348 Stämmen 17 Mal unabhängig voneinander auftrat, während die NimB-Promotor-Mutation 15 Mal auftrat, wodurch beide Varianten im 99,9. Perzentil der Homoplasien liegen. Diese Ergebnisse weisen auf eine positive Selektion hin und legen nahe, dass die Verwendung von Metronidazol zusätzlich zu Fluorchinolonen einen wichtigen Selektionsdruck ausübte, der die jüngste Anpassung von C. difficile prägte.

ein Manhattan-Diagramm, das SNPs zeigt, die signifikant mit der Häm-induzierten Metronidazol-Resistenz (HMR) assoziiert sind. Von pySEER berechnete angepasste, logarithmisch transformierte p-Werte werden nach Genomposition aufgetragen. Es wurden standardmäßige statistische Analysen verwendet, die in pySEER erstellt wurden. Sowohl gyrA- als auch nimB-SNPs sind sehr signifikant mit HMR assoziiert. b Maximum-Likelihood-Phylogenie basierend auf Gesamtgenomsequenzen von 348 Isolaten. Multi-Locus-Sequenztyp (MLST) Clades 1–5 (innerer Kreis), gyrA- und nimB-Promotor-Mutationen (mittlerer Kreis) und Metronidazol-Empfindlichkeit (äußerer Kreis), entweder Häm-induzierte Metronidazol-resistent (HMR) oder Metronidazol-empfindlich (S ), werden gezeigt. Die gyrA-, nimB-Promotor-Mutationen und die damit verbundene HMR sind mit klonalen Gruppen in den Klassen 2 und 1 assoziiert, was darauf hindeutet, dass sich Bakterien, die diese Varianten tragen, schnell ausgebreitet haben und/oder in dieser Population häufiger beprobt werden.

Für jedes Isolat in der Probe wird eine Maximum-Likelihood-Phylogenie angezeigt, die aus den Sequenzdaten des gesamten Genoms abgeleitet wird, wobei die zugehörige Metronidazol-Empfindlichkeit, Clade und das GyrA/nimB-Promotor-Allel angegeben sind (Abb. 4b). Die Phylogenie zeigt, dass die PnimBG-Mutation fast ausschließlich in Verbindung mit der gyrA-Mutation auftritt. Während mehr Isolate (n = 34) die gyrA-Mutation allein trugen als die nimB-Mutation (n = 2), trugen die meisten Isolate mit der gyrA-Mutation auch die PnimBG-Variante. C. difficile kann in fünf Hauptklassen5 eingeteilt werden. In unserer Stichprobe waren diese gleichzeitig auftretenden Varianten hauptsächlich mit Klade 2 und in geringerem Maße mit Klade 1 assoziiert, wohingegen sie in den Kladen 3 und 5 fehlten (Abb. 5g).

Maximum-Likelihood-Phylogenien einzelner Clades 1–5 mit gefärbten Spitzen entsprechend der Anwesenheit oder dem gemeinsamen Vorkommen von gyrA- und nimB-SNPs aus dieser Studie sowie Ref. 24. eine Gruppe 1; b Klade 2, einschließlich „globaler“ Isolate aus Ref. 24 und diejenigen in dieser Studie. Das rosa Dreieck stellt die klonale Gruppe dar, von der alle bis auf einen beide SNPs haben; (c) Einschub, der Details der klonalen Gruppe innerhalb der Klade 2 zeigt (mit einer Ausnahme (blauer Punkt; nur gyrA), Isolate mit der gyrA-Mutation kodierten auch die nimB-Mutation; d Klade 3; e Klade 4; und f Klade 5. g Wärmekarte, die die Häufigkeit von SNP-Präsenz/gleichzeitigem Vorkommen und MTZ-Resistenz-Phänotyp innerhalb jeder Gruppe unserer Stichprobe zeigt. Jede Zeile entspricht einer einzelnen Gruppe. Jede Spalte enthält eine Zusammenfassung der gyrA- und nimB-SNP-Präsenz und des MTZ-Resistenz-Phänotyps. Die Wärmekarte ist schattiert durch den Prozentsatz jeder Bedingung innerhalb jeder Gruppe, sodass die Summe über eine einzelne Zeile 100 % beträgt. 88 % der Isolate der Gruppe 2 sind HMR mit sowohl gyrA- als auch nimB-SNPs, während 100 % der Isolate der Gruppe 3 MTZ-anfällig sind und keines von beiden aufweisen SNP von Interesse.

Innerhalb der Klassen 1 und 2 waren die gyrA- und PnimBG-Mutationen mit großen klonalen Gruppen assoziiert (Abb. 4b), was darauf hindeutet, dass Stämme mit diesen Varianten schnell übertragen wurden. Um diese Hypothese zu testen, haben wir den globalen Datensatz (n = 119) aus Lit. erneut analysiert. 24, die zuvor festgestellt hatten, dass gyrA-Mutationen mit der weltweiten epidemischen Ausbreitung von C. difficile, das mit dem Gesundheitswesen in Zusammenhang steht, verbunden sind. Unsere erneute Analyse dieser veröffentlichten Genome ergab, dass alle bis auf eines der Isolate, die die gyrA-Mutation trugen, auch die PnimBG-Variante trugen. Zusammengenommen legen diese Beobachtungen nahe, dass Mutationen an der NimB-Promotor-Stelle für den Großteil der Metronidazol-Resistenz verantwortlich sind (Abb. 5b, c) und somit wahrscheinlich eine entscheidende Rolle bei der nachlassenden Wirksamkeit dieser Behandlung spielten. Wir verknüpfen außerdem Metronidazol-Resistenz mit Fluorchinolon-Resistenz und finden Hinweise darauf, dass die Kombination von Resistenzen der jüngsten weltweiten Ausbreitung von C. difficile-Stämmen im Gesundheitswesen zugrunde liegt, insbesondere denen, die zur Gruppe 2 gehören.

Unsere Studie identifizierte auch Häm-abhängige Metronidazol-resistente Stämme, denen das PnimBG-SNP fehlte (Supplementary Data 1). Die molekulare Analyse von zwei dieser Stämme (dh 17/27 [RT001] und 25603 [RT137) zeigte, dass ihr Resistenzphänotyp auch durch nimB beeinflusst wird. In beiden Stämmen waren die nimB-mRNA-Spiegel höher als die in anfälligem CD196 oder CD630 (ergänzende Abbildung 12a, b). Als nimB mithilfe von pMSPT (dem gepaarten ATc-induzierbaren System mit gepaarten Termini)42 zum Schweigen gebracht wurde, wurden beide Stämme anfälliger für Metronidazol (ergänzende Abbildung 12c). Die MHK von 25603 wurde von 2 bis 4 µg/ml auf 0,25–0,5 µg/ml reduziert, ähnlich wie bei den in Abb. 2 getesteten RT027-Stämmen. Die MHK gegen 17/27 wurde jedoch von 8–16 µg/ml auf 2 gesenkt –8 µg/ml (Median von 4 µg/ml, ergänzende Abb. 12c). Es ist möglich, dass 17/27 über zusätzliche Metronidazol-Resistenzmechanismen verfügt. Weitere chromosomal vermittelte Mechanismen der Metronidazol-Resistenz bei C. difficile umfassen Mutationen zu PFOR, Manipulationen des Eisen- und Elektronentransportstoffwechsels18,57. Alternativ kann es möglich sein, dass das Antisense im Vektor pMSPT über verschiedene Ribotypen hinweg nicht optimal ist. Dennoch zeigen diese Ergebnisse, dass die meisten Häm-abhängigen Metronidazol-resistenten Stämme zwar PnimBG kodieren, eine Minderheit dieser Stämme jedoch über alternative Transkriptions- oder Posttranskriptionsmechanismen zu verfügen scheint, die NimB regulieren.

In den letzten zwei Jahrzehnten ging die weltweite Ausbreitung des epidemischen C. difficile mit einem Rückgang der Wirksamkeit von Metronidazol einher, was dazu führte, dass es in wichtigen Leitlinien als empfohlene Erstlinienoption für CDI gestrichen wurde. Wir haben kürzlich gezeigt, dass eine Häm-abhängige Resistenz gegen Metronidazol, definiert durch einen MHK-Bruchpunkt von ≥ 1 µg/ml, mit einem erhöhten Risiko für ein klinisches Versagen von Metronidazol verbunden ist58. Grundlegend für diesen Befund war die Entdeckung, dass Häm für den Nachweis von Metronidazol-resistentem C. difficile22,23 von entscheidender Bedeutung ist. Unsere Erkenntnisse, dass die meisten Metronidazol-resistenten Stämme eine T-zu-G-Mutation (PnimBG) im −10-Promotor von C. difficile nimB entwickelten, liefern eine mikrobielle genetische Erklärung dafür, warum solche Stämme möglicherweise weniger auf eine Metronidazol-Therapie ansprechen. Darüber hinaus aktualisiert die Tatsache, dass PnimBG zusammen mit der Thr82Ile-Substitution in GyrA auftritt, das Paradigma für die globale Verbreitung epidemischer Stämme24, was darauf hindeutet, dass CDI-Ausbrüche durch Stämme vermittelt wurden, die nicht nur gegen Fluorchinolone, sondern auch gegen Metronidazol resistent sind. Diese doppelten Arzneimittelresistenzen verschafften dem epidemischen C. difficile wahrscheinlich einen Vorteil im Gesundheitswesen. Mehrere Beweislinien stützen PnimBG als Ursache einer weit verbreiteten Metronidazol-Resistenz, einschließlich unseres GWAS unter Verwendung zweier unabhängiger Methoden (Abb. 4a, ergänzende Abb. 11, ein zuvor veröffentlichtes GWAS unabhängiger Proben59, unsere Dokumentation der Mutation, die in vivo in einem Metronidazol auftritt). -behandelten Patienten und deren mechanistische genetische Validierung, wie unten erläutert.

Our analyses of population-level genomic data found nimB and gyrA variants are advantageous, as expected for drug resistance mutations. The two mutations were strongly linked, and phylogenetic analyses suggest that strains carrying both mutations spread more rapidly in healthcare settings (Figs. 4b, 5a–f). This hypothesis is consistent with previously published data suggesting that fluroquinolone-resistant C. difficile spread rapidly across continents24,25,26. We found the combination of nimB and gyrA mutations in Clade 2 and to a lesser extent Clade 1 (Figs. 4b, 5a–f). This association could reflect niche specialization among the Clades. Large scale surveys of C. difficile genomic data have identified high rates of carriage of both antimicrobial resistance determinants and toxin genes in Clade 221,59,60. This genetic cargo reflects adaptation of Clade 2 to the antibiotic milieu of health care settings and pathogenicity in human diarrheal disease21,25. Clade 5 is similarly associated with antibiotic resistance and increased virulence59, but we did not identify the nimB-promoter mutation in our sample of Clade 5 isolates (Fig. 5f). Clade 5 antimicrobial resistance determinants reflect the livestock and farming environments that are associated with this Clade21 and absence of the nimB-promoter mutation from this Clade could reflect the distinct antibiotic selection pressures encountered in these environments. It is also possible that the nimB-promoter mutation, and resulting heme-dependent metronidazole resistance, is a human-specific adaptation. Given the small number of Clade 5 isolates included in our analyses, a larger sample size will be required to test this hypothesis. An alternative, but not mutually exclusive, explanation for the observed associations between the nimB-promoter mutation, the gyrA mutation and the Clade 2 genetic background is epistasis, i.e., interactions among genetic loci that affect cell physiology. It is striking that the nimB mutation almost exclusively appears among strains with the gyrA mutation (Fig. 4b). A potential explanation for this phenomenon is that the nimB-promoter mutation and constitutive formation of nimB imposes a metabolic burden and fitness costs that might be ameliorated in strains with the gyrA mutation. However, isogenic 23468 and 23475, which are resistant and susceptible respectively, did not show significant differences in growth rates (Supplementary Fig. 3). On the other hand, Thr82Ile mutation in GyrA either marginally enhances fitness or has no fitness costsIle on Clostridioides difficile fitness. J. Antimicrob. Chemother. 74, 877–884 (2019)." href="/articles/s41467-023-39429-x#ref-CR61" id="ref-link-section-d282361552e2966"> 61,62. Zukünftige Studien werden erforderlich sein, um anhand klinisch reflektierender Tier- und In-vitro-Modelle zu bestimmen, inwieweit eine gleichzeitig bestehende Resistenz gegen Metronidazol und Fluorchinolon die Übertragung durch C. difficile beeinflusst.

Wir haben herausgefunden, dass CdNimB sowohl enzymatisch als auch in Zellen als Nitroreduktase fungiert und Häm benötigt, um effektiv Aminoendprodukte zu produzieren. Dem akzeptierten Modell zufolge wandeln Nim-Proteine ​​Nitroimidazole in Amine um, indem sie insgesamt sechs Elektronen schnell von ungelösten Cofaktoren auf die Nitrogruppe übertragen35,45. Dieser Bedarf an Häm könnte erklären, warum Nim-Proteine ​​in enzymatischen Tests keine Nitroreduktase-Aktivität aufweisen, sondern zellulär in Häm-haltigen Brühen beobachtet wurden35. Nim-Proteine ​​sind strukturell und funktionell homolog zum Flavoenzym Anf3, bei dem benachbarte Häm- und Flavin-Bindungsdomänen vermutlich einen schnellen Elektronentransfer zwischen den beiden Cofaktoren ermöglichen. Basierend auf dem homodimeren Homologiemodell der Anf3-Struktur (Abb. 3b) und der Biochemie von Häm-Flavoenzymen spekulieren wir, dass CdNimB die Nitroimidazol-Nitrogruppen mit Elektronen von Häm- oder Flavin-Cofaktoren im homodimeren Protein reduzieren könnte. Weitere Forschung ist erforderlich, um diese Hypothesen in optimaleren biochemischen und biophysikalischen Experimenten zu testen und die molekularen Mechanismen zu ermitteln, durch die Nim-Proteine ​​Nitroimidazole reduzieren. Da in unseren Experimenten millimolare Substratkonzentrationen verwendet wurden, sollten diese weiteren Studien eine Analyse der kinetischen Parameter des Enzyms umfassen. Dies ermöglicht eine genauere Beurteilung der katalytischen Effizienz des Enzyms bei der Reduzierung physiologischer mikromolarer Konzentrationen von Metronidazol. Insgesamt identifizierte unsere Studie nimB zum ersten Mal als ein kryptisches Metronidazol-Resistenzgen, das mit der C. difficile-Epidemie in Zusammenhang steht. Bemerkenswert ist, dass intravenöses Metronidazol zusammen mit Vancomycin bei fulminantem CDI von IDSA/SHEA und ESCMID immer noch empfohlen wird7,8 und Metronidazol wird in den Vereinigten Staaten63 und in anderen Ländern, in denen es immer noch zur Behandlung von CDI empfohlen wird, weiterhin häufig verwendet64,65. Daher liefert diese Studie mehrere wichtige Erkenntnisse, die zur Modernisierung des Einsatzes von Metronidazol und anderen CDI-Medikamenten durch evidenzbasierte Ansätze genutzt werden könnten. Um dies zu erreichen, sind schnelle Empfindlichkeitstests, genomische Überwachung und mechanistische Forschung erforderlich, um herauszufinden, wie Resistenzallele die klinischen Ergebnisse beeinflussen.

Die verwendeten C. difficile-Stämme sind in den Zusatzdaten 1 zu finden, einschließlich der Zugangsnummern der in der NCBI-Datenbank hinterlegten Genomen. Die geografischen Standorte, an denen Stämme isoliert wurden, sind angegeben: Für GWAS wurden Stämme wie dokumentiert in den Vereinigten Staaten, Europa und Israel sowie an anderen Standorten isoliert; andere Stämme stammten vom Texas Medical Center. Ebenfalls enthalten waren Stämme, die vom United States Centers for Disease Control and Prevention Emerging Infections Program66 gemeldet wurden. B. fragilis 638R/pIP417 (Stamm DSM103646) und DSM2151 stammten vom Leibniz-Institut DSMZ; DSM2151 ist ein Kontrollstamm für Antibiotika-Empfindlichkeitstests. Alle Stämme von C. difficile oder B. fragilis wurden in vorreduzierter Brain Heart Infusion (BHI)-Brühe über Nacht bei 37 °C in einer anaeroben Whitley A35-Workstation (Don Whitley Scientific) kultiviert.

Die MHK-Werte wurden mit der Agar-Verdünnungsmethode auf BHI-Agar mit oder ohne 5 µg/ml Schweinehämin (Alfa Aesar, Katalog-Nr. A11165) und doppelten Verdünnungen von Metronidazol (0,125–32 µg/ml; von Acros, Katalog-Nr. 210340050), wie zuvor beschrieben23, durch Beimpfen von Agars mit 2 μl Übernachtkulturen, die 104–105 KBE/Spot enthalten. Es wurde gezeigt, dass Metronidazol-Empfindlichkeitstests bei BHI mit Wilkins Chalgren- und Brucella-Agars vergleichbar sind23. Metronidazol- und Hämin-Stammlösungen wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) hergestellt (Alfa Aesar, Katalog-Nr. 43998). Die Platten wurden bis zu 48 Stunden lang inkubiert und die MHK als niedrigste Wirkstoffkonzentration aufgezeichnet, die das sichtbare Wachstum hemmte. MHK-Bestimmungen für 2-Nitroimidazol (Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. 195650) wurden auf ähnliche Weise durchgeführt.

Das Plasmid pRPF215, ein Himar1-Mariner-Abgabevektor30, wurde in R20291 aus E. coli SD46 und R20291-Transkonjuganten konjugiert, die auf BHI-Agars, ergänzt mit 250 µg/ml Cycloserin (Matrix Scientific, Katalog-Nr. 072929), 8 µg/ml Cefoxitin (Chem -Impex International, Katalog-Nr. 01490) und 15 µg/ml Thiamphenicol (Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. T0261). Um Tn-Mutanten zu erzeugen, wurde R20291-pRPF215 über Nacht in BHI-Brühe mit 15 µg/ml Thiamphenicol gezüchtet und dann in BHI bis zu einer OD600 nm von 0,2 subkultiviert. Himar1 wurde mit 100 ng/ml Anhydrotetracyclin (ATc) (Alfa Aesar, Katalog-Nr. J66688) zur Mutagenese über Nacht (15 Stunden) induziert. Tn-Mutanten wurden durch Ausbreiten von Kulturverdünnungen auf vorreduziertem BHI-Agar mit 20 µg/ml Lincomycin selektiert. Nach der Inkubation (24 Stunden) wurden die Kolonien in 96 Deep-Well-Platten gesammelt, um 7488 unabhängige Kolonien anzuhäufen. Die Bibliothek wurde auf Metronidazol-empfindliche Tn-Mutanten gescreent, indem über Nacht Kulturen in BHI mit Lincomycin gezüchtet wurden und 2 μl Inokula auf BHI-Agars mit 0,5 µg/ml Metronidazol und 5 µg/ml Hämin unter Verwendung einer 96-Well-Tischpipette aufgetüpfelt wurden. Vermutlich Metronidazol-empfindliche Tn-Mutanten wurden durch MIC-Tests bestätigt und einer Genom- und Sanger-Sequenzierung unterzogen, um die Insertionsstellen für ermB zu bestätigen. Die verwendeten Primer und Stammkonstrukte sind in den Zusatzdaten 2 und 3 aufgeführt.

Der Vektor pMTL-SC7215-CD2517.1 wurde durch Modifizieren des Vektors pMTL-SC7215 erstellt, indem das Cytosin-Deaminase (codA)-Gen durch das Toxin-Antitoxin-System CD2517.1 Typ I als gegenselektierbar ersetzt wurde, im Wesentlichen wie zuvor beschrieben67. Um nimB durch Allelaustausch zu löschen, wurde eine 1000-bp-Kassette der stromaufwärts und stromabwärts gelegenen flankierenden Regionen von Genscript synthetisiert, in pMTL-SC7215-CD2517.1 kloniert und in R20291 konjugiert. Nach acht aufeinanderfolgenden Passagen in BHI wurden die Kulturen mit ATc (70 ng/ml) auf Agar ausplattiert und die Kolonien mittels PCR und Sanger-Sequenzierung auf Verlust von nimB untersucht.

Um nimB unter seinem einheimischen Promotor zu überexprimieren, wurde nimB zusammen mit seiner 504-bp-Upstream-Sequenz zwischen KpnI- und BamHI-Stellen des Vektors pRPF185 kloniert, wodurch pRPF185-PnimB entstand. Die Überexpression von nimB unter dem Anhydrotetracyclin-induzierbaren Promotor (Ptet) erfolgte durch Klonierung des Gens mit seiner Ribosomenbindungsstelle in pRPF185, wodurch pRPF185-PATcnimB entstand. Plasmidkonstrukte wurden in C. difficile aus E. coli SD46 konjugiert und Stämme wurden in BHI-Brühe mit 15 µg/ml Thiamphenicol gezüchtet. MHK-Bestimmungen wurden wie zuvor angegeben durchgeführt, jedoch in Platten, denen Thiamphenicol (15 µg/ml) und ATc (32 ng/ml) speziell für pRPF185-PATcnimB zugesetzt waren. Der Translations-Knockdown wurde wie beschrieben durchgeführt42, wobei eine von Genscript synthetisierte 100-bp-Antisense-RNA, die 50-bp stromaufwärts und stromabwärts von nimB ab dem Startcodon umfasst, in SphI- und XhoI-Stellen des Vektors pMSPT kloniert wurde. Die Induktion des Gen-Knockdowns wurde mit 64 ng/ml ATc durchgeführt. Die CRISPR-Interferenz erfolgte wie beschrieben42, wobei die auf NimB gerichtete Leit-RNA von Genscript synthetisiert und in die PmeI-Stelle des Vektors pXWxyl-dcas9 kloniert wurde. Die Guide-RNA wurde mit 1 % Xylose (Alfa Aesar, Katalog-Nr. A10643) induziert. Die verwendeten Primer und Stammkonstrukte sind in den Zusatzdaten 2 und 3 aufgeführt.

Die 504-bp-Upstream-Region von nimB wurde in NheI- und SacI-Stellen des pDSW1728-Vektors kloniert, um PnimBG::mCherryOpt oder PnimBT::mCherryOpt aus R20291 bzw. CD196 zu erzeugen. Konstrukte und die leere Vektorkontrolle wurden in verschiedene C. difficile-Stämme konjugiert. Stämme, die das Reporterkonstrukt und den leeren Vektor trugen, wurden aus Übernachtkulturen auf OD600 nm ~ 0,3 gezüchtet. Jede Kultur wurde entweder mit DMSO-Kontrolle, Metronidazol (2 µg/ml), Metronidazol (2 µg/ml) plus Hämin (5 µg/ml) oder Hämin allein (5 µg/ml) behandelt und 1 Stunde lang anaerob inkubiert. Anschließend wurden die Proben wie zuvor beschrieben41 fixiert und die Fluoreszenz im BioTek Synergy-Lesegerät bei einer Anregung von 554 nm und einer Emission von 610 nm gemessen. Der Fluoreszenzwert für jede Probe wurde dann basierend auf ihrer Kulturdichte (OD600-nm-Werte) normalisiert. Die verwendeten Primer und Stammkonstrukte sind in den Zusatzdaten 2 und 3 aufgeführt.

Gene, die für Anf3 und NimA aus A. vinelandii bzw. B. fragilis kodieren, wurden mithilfe der JCat-Plattform68 für die Translation in C. difficile codonoptimiert. Eine synthetische Ribosomenbindungsstelle für jedes Gen wurde mit RBS Calculator v2.169 entworfen und vor dem Startcodon platziert und das Ensemble wurde von Genscript synthetisiert. Anschließend wurden sie in den pRPF185-Vektor subkloniert und vom Ptet-Promotor unter Verwendung von 8 ng/ml ATc exprimiert. Die verwendeten Primer und Stammkonstrukte sind in den Zusatzdaten 2 und 3 aufgeführt.

R20291 wurde in BHI-Brühe auf eine OD600 nm von 0,2 gezüchtet und einer DMSO-Kontrolle, Metronidazol (2 µg/ml), Metronidazol (2 µg/ml) plus Hämin (5 µg/ml) oder Hämin allein (5 µg/ml) ausgesetzt 30 Minuten. Die RNA wurde mit Qiagen RNeasy miniKit (Qiagen, Valencia, CA) extrahiert und mit TURBO™ DNase (Thermofisher Scientific) behandelt. Die RNA-Sequenzierung wurde dann von GENEWIZ, LLC durchgeführt. (South Plainfield, NJ, USA), durch 2 × 150 Paired End (PE)-Konfiguration von Illumina HiSeq. Rohe RNA-seq-Daten wurden auf die Galaxy-Plattform hochgeladen (https://usegalaxy.org/). Die Qualitätskontrolle wurde mit FastQC (Galaxy-Version 0.72+Galaxy1) und multiFastQC (Galaxy-Version 1.7) durchgeführt. Das Trimmen erfolgte mit Trim Galore (Galaxy-Version 0.4.3.1), um Adaptersequenzen zu entfernen. Lesevorgänge wurden mithilfe des BWA-MEM-Programms (Galaxy-Version 0.7.17.1) der R20291-Referenz FN545816.1 zugeordnet. Counts per Read wurden mit htseq-count (Galaxy-Version 0.6.1galaxy3) generiert, während die differenzielle Genexpression mit Degust (http://degust.erc.monash.edu/) unter Verwendung von EdgeR (Cut-offs absolutes log2 ≥ 1 und) durchgeführt wurde FDR ≤ 0,01).

Aus der Gesamt-RNA wurde die cDNA-Synthese mit dem qScript cDNA Supermix-Kit (Quantabio) durchgeführt. qPCRs wurden in 20-µL-Reaktionen unter Verwendung des qScript 1-Step SYBR Green qPCR-Kits (Quantabio) auf einem ViiA 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) durchgeführt; Zur Normalisierung wurde 16S-rRNA verwendet. Die Genexpression wurde mit der Standard-ΔΔCT-Methode berechnet. Die konstitutive Genexpressionsanalyse wurde relativ zu Metronidazol-empfindlichen Stämmen berechnet. Die verwendeten Primer sind in den Zusatzdaten 2 aufgeführt.

Ein Homologiemodell von R20291 CdNimB wurde aus der dimeren Proteinstruktur von B. thetaiotaomicron NimB mit gebundenem FAD (PDB 2FG9, Auflösung 2,20 Angström [https://www.rcsb.org/structure/2FG9]) generiert. Zur Erstellung und Verfeinerung des Modells wurde erstklassige Software der Schrödinger-Molekularmodellierungssuite 2020-2 verwendet70,71. Die BtNimB- und CdNimB-Modelle wurden mithilfe der Schrödinger-Software an die Anf3-Nitrogenase von A. vinelandii (PDB 6RK0, Auflösung 0,99 Angström43 [https://www.rcsb.org/structure/6RK0]) angepasst.

Häm-bindende Reste wurden durch Ausrichtung von CdNimB mit bekannten Häm-bindenden Proteinen der Pyridoxamin-5′-Phosphat-Oxidase-Familie, Analyse in Hemoquest und Strukturvergleich mit Anf3 vorhergesagt. Punktmutationen wurden in pRPF185-PnimB durch standardmäßige DpnI-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese erzeugt, Varianten wurden durch Sanger-Sequenzierung bestätigt und in C. difficile konjugiert. Die Empfindlichkeit gegenüber Metronidazol oder 2-Nitroimidazol wurde wie oben beschrieben bestimmt. Die verwendeten Primer sind in den Zusatzdaten 2 aufgeführt.

Gene, die für NimB oder die NimB-His55Ala-Variante kodieren, wurden in pWL613a, ein Derivat des pET28b-Plasmids, kloniert. Sie wurden in E. coli BL21 (DE3) transformiert, in Terrific Broth mit 8 µM Hämin gezüchtet und mit 0,4 mM IPTG 18 Stunden lang bei 14 °C induziert. Die geernteten Kulturen wurden in Puffer (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 M NaCl, 10 mM Imidazol, 18 % Glycerin, 5 mM β-Mercaptoethanol, 1X Proteaseinhibitor-Cocktail, 0,01 mg/ml DNase, 8 µM Hämin) suspendiert und 5 mM MgCl2), lysiert durch French Press 28.000 psi, His-markierte Proteine ​​wurden aus Ni-NTA-Säulen (Marvelgent Biosciences Inc.) gereinigt und 20 Stunden lang bei 4 °C in Puffer [20 mM Tris-HCl (pH 8)] dialysiert. 0), 0,25 M NaCl, 18 % Glycerin und 5 mM β-Mercaptoethanol].

Nim-Proteine ​​wurden wie oben gereinigt, jedoch ohne Zugabe von Hämin zur E. coli-Kultur und zum Lysepuffer. Um festzustellen, ob die Proteine ​​mit gebundenem Häm gereinigt wurden, wurden die Proben mit dem Hemin Assay Kit (Sigma MAK036) gemäß dem Protokoll des Herstellers getestet. Dialysierte Proben von Wildtyp und Ala-55 CdNimB 50 µl wurden mit 50 µl der Reaktionsmischung in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen gemischt. Die Reaktion wurde 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert, bevor die Absorption bei 570 nm gemessen wurde. Die Konzentration an gebundenem Hämin/Häm wurde anhand einer Standardkurve von Hämin bestimmt; DNase diente als Negativkontrolle. Die Ergebnisse liefern ein halbquantitatives Maß für Häm, das von den Testenzymen bis zur Peroxidase im Hämin-Assay-Kit verfügbar wird.

Die Fähigkeit von Nim, Häm zu binden, wurde durch Absorptionsspektroskopie72 bestimmt, bei der das Protein mit Häm titriert wird. Um die Hämbindung zu bestimmen, wurde Protein (10 µM) in Puffer (20 mM Tris-HCl [pH 8,0], 0,25 M NaCl, 18 % w/v Glycerin und 5 mM β-Mercaptoethanol) verwendet, um die Absorptionsspektren zwischen 350 und zu sammeln 700 nm in 2-nm-Schritten in Polystyrol-24-Well-Platten im Dunkeln. Das Protein wurde durch schrittweise Zugabe von Hämin aus 1 mM Stammlösung in DMSO titriert und die Absorptionsspektren wurden nach 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur mit dem Synergy H1 BioTek-Mikroplattenlesegerät aufgezeichnet. Die Titration wurde fortgesetzt, bis keine weitere signifikante Änderung in den Spektren mehr auftrat, was auf eine Sättigung hindeutete. Die Spektren des häminhaltigen Puffers wurden unter den gleichen Bedingungen aufgenommen und von den Proteinproben subtrahiert. Die Hämbindung wurde in Diagrammen der Absorptionsänderung bei 416 nm (Soret-Bande) gegen die Häminkonzentration und qualitativ durch Visualisierung gepoolter Proben analysiert.

Die NimB-Nitroreduktase-Aktivität wurde unter Verwendung der Substrate 4-Nitrobenzoesäure, 2-Nitroimidazol, Metronidazol, Dimetridazol mit Kontrollen wie Natriumbenzoat, Imidazol und Vancomycin getestet. 4-Nitrobenzoesäure und Imidazol stammten von Alfa Aesar, Katalog-Nr. A14738 bzw. A10221; Vancomycin, Dimetridazol und Natriumbenzoat stammten aus den Sigma-Aldrich-Katalognummern. V2002, D4025 bzw. 109169. Der Test wurde in einer anaeroben Kammer durchgeführt. Die Reaktion wurde in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt, die 50 mM KPO4-Puffer mit 10 µM Hämin, 3 mM NADPH (Cayman, Katalog-Nr. 9000743), 10 µM FAD (Cayman, Katalog-Nr. 23386) und 7,5 U/ml Pyranoseoxidase enthielten (Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. P4234), 1 KU/ml Katalase (Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. C9322), 50 mM Glucose und 5 mM Substrat; Aufarbeitungsexperimente testeten NADPH bei 0,3–6 mM. Pyranoseoxidase-Katalase wurde, wie bereits berichtet, zur Entfernung von Restsauerstoff verwendet43, wobei die zusammengesetzten Komponenten (außer CdNimB) 1 Stunde lang bei 37 °C vorinkubiert wurden. Als nächstes erfolgte die Zugabe von CdNimB, Wildtyp oder His55Ala-Variante, bis zu einer Endkonzentration von 9,7 µM und die Inkubation wurde 2 Stunden lang fortgesetzt. Bei der Reaktion wurden 5 mM Substrat verwendet, um nachweisbare Mengen an 5-Aminoimidazol-Produkt aus Metronidazol sicherzustellen, da mikromolare Konzentrationen von Metronidazol nicht zum Nachweis von Aminen führten, was wahrscheinlich auf die bekannte chemische Instabilität von 5-Aminoimidazol zurückzuführen ist51,52. Diese Konzentration wurde auch als Standardkonzentration für alle anderen Testsubstrate und Kontrollen verwendet. Primäre nitroaromatische Amine wurden mithilfe der Bratton-Marshall-Testreagenzien73,74 nachgewiesen. Der Nachweis und die Quantifizierung der 2-Aminoimidazol-Bildung aus der 2-Nitroimidazol-Reduktion erfolgte ebenfalls mittels LC-MS/MS, da 2-Aminoimidazol erheblich stabiler ist als 5-Aminoimidazole.

In der anaeroben Kammer wurde ein gleiches Volumen 20 % kalter Trichloressigsäure (TCA) (Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. T0699) zur Reaktionsmischung gegeben und nach 30 Minuten auf Eis wurden 200 µL Überstand mit 25 µL gemischt von 0,1 % Natriumnitrit (Alfa Aesar, Katalog-Nr. A18668). Nach 10 Minuten wurden 25 µL 0,5 % w/v Ammoniumsulfamat (Alfa Aesar, Katalog-Nr. A17696) hinzugefügt, gefolgt von 25 µL 0,05 % N-(1-Naphthyl)ethylendiamin-Dihydrochlorid (Alfa Aesar, Katalog-Nr. A17164). . Nach 20 Minuten wurde die Absorption bei 540 nm mit einem VERSA Max-Mikroplattenlesegerät gemessen. Standardkurven wurden unter Verwendung von 4-Aminobenzoesäure (Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. A9878) und 2-Aminoimidazol (Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. CDS020502), hergestellt in DMSO, erstellt; Für 5-Aminoimidazol konnte keine Standardkurve erstellt werden, da diese Chemikalie instabil und im Handel nicht erhältlich ist.

Nach der Inkubation der enzymatischen oder enzymfreien Reaktionen wurden die Proben mit kaltem TCA (10 % v/v) präzipitiert. Nach 30 Minuten auf Eis wurden die Überstände gesammelt, bei –80 °C gelagert und LC-MS/MS am Baylor College of Medicine (BCM) NMR and Drug Metabolism Advanced Technology Core oder der Texas A&M University (TAMU) Chemistry Mass Spectrometry Facility durchgeführt. Diese Methode wurde auch verwendet, um die Bildung von 2-Aminoimidazol in Zellen wie folgt zu messen. Logarithmisch wachsende Zellen (OD600 nm ∼0,3) wurden 20-fach konzentriert und DMSO-Kontrolle, 2-Nitroimidazol (2 mM), 2-Nitroimidazol (2 mM) plus Hämin (5 µg/ml) oder Hämin allein (5 µg/ml) ausgesetzt ) und 3 Stunden lang anaerob inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit TCA (10 % (v/v)) behandelt und die Überstände wurden gewonnen. Bei BCM wurde LC-MS/MS durch Verdünnen der Proben in Methanol durchgeführt. 2-Aminoimidazol wurde durch gekoppelte UHPLC aufgetrennt, identifiziert und quantifiziert Q Exactive Orbitrap MS (Thermo Fisher Scientific), ausgestattet mit einer Säule von 50 mm × 4,6 mm (XDB C-18, Agilent Technologies). MS-Daten wurden von 50 bis 1000 Da im Profilmodus und Referenzionen bei m/z 371,1012 erfasst. Ein Standard Für 2-Aminoimidazol wurde eine Kurve erstellt, um die Konzentrationen in Proben zu bestimmen, und die Ergebnisse wurden pro Proteingehalt normalisiert. Die Ergebnisse von LC-MS/MS bei BCM sind in Abb. 3j dargestellt. Bei TAMU wurde LC-MS/MS durch Verdünnen und Filtern durchgeführt Proben in Acetonitril. Die Proben wurden mit einem Thermo Scientific Q Exactive Focus in Verbindung mit einer LC-Einheit (Ultimate 3000 RS) analysiert, ausgestattet mit einer Accucore-150-Amid HILIC-Säule (2,1 × 150 mm; 2,6 µm) (Thermo Scientific). Die Q Die Exactive Focus ESI-Quelle wurde im Voll-MS (50–200 m/z) betrieben, wobei die Massenauflösung auf 70.000 FWHM bei m/z 200 eingestellt war. Die Quantifizierung von 2-Aminoimidazol erfolgte durch Auftragen der Peakfläche des extrahierten Ionenchromatogramms (m/z). z 84,0556) gegen die Konzentration des entsprechenden Kalibrierstandards. Die Ergebnisse der LC-MS/MS an der TAMU sind in Abb. 3i und der ergänzenden Abb. 9 dargestellt.

Für genomweite Assoziationsstudien und Populationsgenetik wurde eine Sequenzierung des gesamten Genoms an klinischen Isolaten von 365 C. difficile durchgeführt. Von diesen Isolaten wurden 99 am Dallas Genome Center der University of Texas aus gemultiplexten DNA-Bibliotheken sequenziert, die mit dem Illumina DNA Prep Kit erstellt und mit Paired-End 2 × 150 bp auf einer Illumina NextSeq™500-Plattform sequenziert wurden. Die verbleibenden 266 Isolate wurden im SeqCenter, LLC Pittsburgh unter Verwendung eines Illumina DNA Prep Kit und IDT 10 bp UDI-Indizes sequenziert und auf einem Illumina NextSeq 2000 sequenziert, was 2x151bp-Reads lieferte. Nach der Sequenzierung wurden die Messwerte der Sequenzierer verwendet, um sicherzustellen, dass die Anzahl der Basen mit einem Qualitätsfaktor von Q30 oder höher der bestellten Gesamtzahl entspricht oder diese übersteigt. Die Daten wurden mit bcl2fastq (v2.20.0.422) demultiplext und Adapter entfernt. Andere in dieser Studie sequenzierte Isolate wurden wie oben bei SeqCenter, LLC durchgeführt.

Wir führten eine referenzbasierte Zusammenstellung an 365 USC difficile-Isolaten und 136 globalen, Clade 2, 027/BI/NAP1 C. difficile-Isolaten aus Referenz durch. 24. Wir haben referenzgesteuerte Assemblies anstelle von De-novo-Assemblys verwendet, um Variationen in intergenen Regionen besser abzufragen. Rohe Sequenzierungsdaten wurden mithilfe einer referenzgesteuerten Assemblierungspipeline (https://github.com/pepperell-lab/RGAPepPipe.git) zusammengestellt. Die Qualität der Sequenzierungsdaten wurde mit FastQC v0.8.1175 bewertet, die Lesevorgänge wurden mit TrimGalore v0.6.4 (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore) gekürzt und dann mit BWA MEM v0 an der R20291-Referenzsequenz FN545816.1 ausgerichtet. 7.1276. Ausrichtungen wurden mit samtools v1.3.177 verarbeitet und Picard v1.183 (http://broadinstitute.github.io/picard/) wurde verwendet, um Duplikate zu entfernen und Leseinformationen hinzuzufügen. Lesevorgänge wurden mit GATK v3.578 neu ausgerichtet und Varianten wurden mit Pilon v1.1679 identifiziert. Abschließend wurde die Montagequalität mit Qualimap BamQC80 bewertet. Wir haben 18 neu sequenzierte Baugruppen und 17 Baugruppen von He et al. verworfen. mit Baugruppen schlechter Qualität, bewertet anhand des Prozentsatzes der an der Referenz ausgerichteten Lesevorgänge mit <70 %. Unser endgültiger Datensatz bestand aus 348 C. difficile-Isolaten (347 Isolate + 1 Referenz) sowie 119 Clade 2 027/BI/NAP1-Isolaten von He et al.; Die durchschnittlichen Lesetiefenwerte des in unseren Analysen verwendeten Datensatzes lagen zwischen 31X und 149X; Die mittlere Abdeckung lag zwischen dem 100-fachen und dem 300-fachen; und alle analysierten Proben hatten eine Übereinstimmung von >70 % mit der Referenz.

Ein phylogenetischer Baum der gesamten Genomsequenzen unserer Isolate wurde mit RAxML v8.2.381 unter Verwendung der Maximum-Likelihood-Methode unter dem General Time Reversible-Modell der Nukleotidsubstitution und der CAT-Näherung der Ratenheterogenität abgeleitet. Der Baum wurde in R mit ggtree82 visualisiert. Die Clade-Typisierung wurde mithilfe von Clade-Vertretern aus Lit. verifiziert. 83. Ein phylogenetischer Baum, der durch Kombination von Clade-2-Isolaten aus dieser Studie und den aus Lit. zusammengestellten Gesamtgenomsequenzen erstellt wurde. 24 wurde auch mithilfe von RAxML und dem GTRCAT-Modell abgeleitet.

Um genetische Varianten zu identifizieren, die mit unserem interessierenden Phänotyp verbunden sind, führten wir eine Fst-Ausreißeranalyse zwischen anfälligen und Häm-abhängigen resistenten Populationen durch. Aus dem gesamten Genom-Alignment aller unserer Isolate haben wir mit SnpSites v2.4.184 ein VCF erstellt und Weir und Cockerhams Fst (wcFst) für bi-allelische SNPs mit vcflib (https://github.com/vcflib/vcflib) und maßgeschneidert berechnet Skripte (https://github.com/myoungblom/Evolution_of_the_GGI/tree/main/Figure5). Um wcFst-Ausreißer zu identifizieren, haben wir unsere Analyse 100x mit zufällig zugewiesenen Phänotypen wiederholt und den in dieser Nullverteilung beobachteten maximalen wcFst-Wert als Signifikanzgrenze verwendet. Wir haben auch pySEER56 mit dem Fixed-Effects-Modell ausgeführt, um mit HMR assoziierte SNPs zu identifizieren.

Die Homoplasieanalyse wurde wie zuvor beschrieben55 unter Verwendung von Treetime85 durchgeführt. Um gyrA- und nimB-SNPs auf Anzeichen von Selektion zu untersuchen, haben wir Ahnensequenzen rekonstruiert und Varianten identifiziert, die mehr als einmal in der Phylogenie auftraten. Anschließend haben wir quantifiziert, wie oft jede Variante beobachtet wurde. Die Verteilung der Anzahl der Vorkommen für jeden SNP wurde ausgewertet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Rohdaten zur Sequenzierung des gesamten Genoms wurden in der NCBI-Datenbank unter den Bioprojektnummern PRJNA914992, PRJNA943263, PRJNA555597, PRJNA940988; Alle Zugangsnummern für einzelne Stämme sind in den Zusatzdaten 1 angegeben. Die in dieser Studie generierten RNA-Seq-Rohdaten wurden in der NCBI-Datenbank unter der Zugangsnummer PRJNA880780 hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Rohdaten für Histogramme in verschiedenen Abbildungen finden Sie in den Quelldaten. Supplementary Data 2 listet die in dieser Studie verwendeten Primer auf. Ergänzende Daten 3 listen genetisch konstruierte Stämme aus dieser Studie auf. Die pySEER-Analyse ist unter https://github.com/myoungblom/cdiff_gwas verfügbar. Alle Daten und Materialien dieser Studie stehen jedem Forscher zum Zweck der Reproduktion oder Erweiterung der Studienergebnisse zur Verfügung. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Die gesamte anwendbare Software und die verwendeten Codes sind in den Methoden angegeben und zitiert und können über die folgenden Links leicht abgerufen werden, zusammen mit Informationen zur Bedienung der Tools. Folgende Software wurde verwendet: GraphPad Prism 9.4.1; RBS-Rechner v2.1; Phyre2; HemoQuest (http://131.220.139.55/SeqDHBM/); JCat-Plattform (http://www.jcat.de); Top-Software in der Schrödinger-Suite für molekulare Modellierung 2020-2; Software auf der Galaxy-Plattform (https://usegalaxy.org/) wie folgt TrimGalore (Galaxy-Version 0.4.3.1), FastQC (Galaxy-Version 0.72+galaxy1) und multiFastQC (Galaxy-Version 1.7), htseq-count (Galaxy-Version 0.6.1galaxy3 ), BWA-MEM-Programm (Galaxy-Version 0.7.17.1); EdgeR auf der Degust-Plattform (http://degust.erc.monash.edu/); bcl2fastq (v2.20.0.422); Referenzgeführte Assembly-Pipeline (https://github.com/pepperell-lab/RGAPepPipe.git); Picard v1.183 (http://broadinstitute.github.io/picard/); TrimGalore v0.6.4 (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore); Erste Ausreißeranalyse mit vcflib (https://github.com/vcflib/vcflib) und maßgeschneiderten Skripten (https://github.com/myoungblom/Evolution_of_the_GGI/tree/main/Figure5); Die pySEER-Analyse ist unter https://github.com/myoungblom/cdiff_gwas verfügbar.

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Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde von R01AI139261 an JGH vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases der National Institutes of Health finanziert. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerfassung, der Interpretation der Ergebnisse oder beim Verfassen und Einreichen des Manuskripts.

Wir sind dankbar für den Erhalt klinischer Stämme von Amos Adler, Universität Tel Aviv, Israel; Paola Mastrantonio, Istituto Superiore di Sanità, Italien; Dale Gerding, Loyola University Medical Center, Vereinigte Staaten; Scott Curry, University of Pittsburgh School of Medicine, Vereinigte Staaten; Mary-Beth Dorr, MODIFY-Studienprogramm, von Merck & Co., Inc.; verschiedene Teilnehmer der Pan-European Longitudinal Surveillance of Antibiotic Resistance among Prevalent Clostridium difficile Ribotypes' Study Group; BEI Resources, National Institute of Allergy and Infectious Diseases an den National Institutes of Health; und das Programm der US-amerikanischen Zentren für die Kontrolle und Prävention neu auftretender Infektionen. Wir danken auch Jordan May für die technische Unterstützung bei der Genomextraktion.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Abiola O. Olaitan, Chetna Dureja.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Caitlin S. Pepperell, Julian G. Hurdle.

Zentrum für Infektions- und Entzündungskrankheiten, Institut für Biowissenschaften und Technologie, Texas A&M Health Science Center, Houston, TX, USA

Abiola O. Olaitan, Chetna Dureja, Wan-Jou Shen, Aditi Deshpande und Julian G. Hurdle

Fachbereich Biologie, University of Waterloo, Waterloo, ON, Kanada

Abiola O. Olaitan

Doktorandenausbildungsprogramm für Mikrobiologie, University of Wisconsin-Madison, Madison, WI, USA

Madison A. Youngblom und Madeline A. Topf

Abteilung für Pharmaziepraxis und translationale Forschung, University of Houston College of Pharmacy, Houston, TX, USA

Anne J. Gonzales-Luna und Kevin W. Garey

Abteilung für Pharmazeutische Wissenschaften, College of Pharmacy, University of Tennessee Health Science Center, Memphis, TN, USA

Kirk E. Hevener

Abteilung für Mikrobiologie, Leeds Teaching Hospitals Trust, Leeds, Großbritannien

Jane Freeman und Mark H. Wilcox

Healthcare Associated Infection Research Group, School of Medicine, University of Leeds, Leeds, Großbritannien

Jane Freeman und Mark H. Wilcox

Department of Biological Sciences, University of Texas at Dallas, Richardson, TX, USA

Kelli L. Palmer

Abteilung für medizinische Mikrobiologie und Immunologie, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin-Madison, Madison, WI, USA

Caitlin S. Pepperell

Medizinische Fakultät, Abteilung für Infektionskrankheiten, University of Wisconsin-Madison, Madison, WI, USA

Caitlin S. Pepperell

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JGH konzipierte das Projekt zunächst. AOO, CD, MAY, MAT, CSP und JGH konzipierten, führten experimentelles Design, Ausführung und Datenanalyse durch und schrieben den ursprünglichen Entwurf. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft. WS, AD und KLP haben Protokolle zur Genomextraktion erstellt; WS und AD trugen zur Erstellung von Protokollen für Empfindlichkeitstests bei. KEH führte eine molekulare Modellierung von NimB durch. KWG und AGL stellten klinische Isolate aus Houston zur Verfügung und überprüften die Ergebnisse der Empfindlichkeitstests. MHW und JF stellten klinische Isolate aus Europa zur Verfügung.

Korrespondenz mit Caitlin S. Pepperell oder Julian G. Hurdle.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt César Rodríguez und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Olaitan, AO, Dureja, C., Youngblom, MA et al. Entschlüsselung eines kryptischen Mechanismus der Metronidazol-Resistenz bei weltweit verbreiteten Fluorchinolon-resistenten Clostridioides difficile. Nat Commun 14, 4130 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39429-x

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Eingegangen: 18. Oktober 2022

Angenommen: 13. Juni 2023

Veröffentlicht: 12. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39429-x

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