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Jun 21, 2023

Anstieg der Nitroimidazol-Hemmkonzentration bei den Entamoeba histolytica-Isolaten, was zu amöbischem Leberabszess führt, und Screening von Andrographolid als zweckentfremdetes Medikament

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12192 (2023) Diesen Artikel zitieren 272 Zugriffe 1 Altmetric Metrics Details Infektionen durch Entamoeba histolytica (E. histolytica) führen zu erheblichen

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 12192 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Infektionen durch Entamoeba histolytica (E. histolytica) führen weltweit zu erheblicher Morbidität und Mortalität und die Behandlung ist auf eine einzige Arzneimittelklasse angewiesen: Nitroimidazole. Behandlungsversagen und zeitweise Berichte über Rückfälle aus verschiedenen Teilen der Welt deuten auf die Entwicklung einer klinischen Arzneimittelresistenz hin. In der vorliegenden Studie wurden klinische Isolate von E. histolytica auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Metronidazol und Tinidazol getestet. Darüber hinaus wurde auch die Anti-Amöben-Eigenschaft der Wirkstoffe von Andrographis paniculata bewertet. Die Prävalenz des Metronidazol-Resistenzgens (nim) bei Krankenhauspatienten wurde ebenfalls untersucht, um einen umfassenden Einblick in die aktuelle Situation der Arzneimittelresistenz bei E. histolytica zu erhalten. Der mittlere Wert der Hemmkonzentration 50 (IC50) von E. histolytica-Isolaten gegen Metronidazol und Tinidazol betrug 20,01 bzw. 16,1 µM. Andrographolid zeigte einen minimalen mittleren IC50-Wert (3,06 µM). Im Vergleich zu Metronidazol wurde eine signifikante prozentuale Hemmung von E. histolytica-Isolaten durch Andrographolid beobachtet (p = 0,0495). Keines der E. histolytica-Isolate zeigte das Vorhandensein des Nim-Gens. In Stuhlproben von Krankenhauspatienten wurde jedoch eine Prävalenz des nimE-Gens von 76,6 % (69/90) bzw. 62,2 % (56/90) in Proben mit Durchfall und ohne Durchfall festgestellt. Die Hemmkonzentration häufig verwendeter Nitroimidazole gegen klinische Isolate von E. histolytica steigt. Die prozentuale Hemmung von E. histolytica-Isolaten durch Andrographolid war signifikant höher als die des Kontrollmedikaments Metronidazol.

Die Wahl der Medikamente zur Behandlung von Infektionen durch Entamoeba hängt in der Regel von der Diagnose und der Schwere der Erkrankung ab. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) empfiehlt, dass alle mit Entamoeba histolytica (E. histolytica) infizierten Patienten behandelt werden sollten1. Aufgrund der Nichtverfügbarkeit und der damit verbundenen Toxizität ist die Behandlung von Infektionen durch E. histolytica jedoch seit mehr als einem halben Jahrhundert auf eine einzige Medikamentenklasse, Nitroimidazole, angewiesen2. Die Sicherheit und Wirksamkeit der Nitroimidazole bei allen Formen der Amöbiasis ist eindeutig belegt3. Der am häufigsten verwendete Wirkstoff aus dieser Klasse ist Metronidazol. Metronidazol war weltweit die erste Wahl bei einer Reihe von anaeroben und Protozoen-Infektionen.

Allerdings haben wahlloser übermäßiger Gebrauch, rezeptfreie Verkäufe (OTC) und unangemessene Behandlungsschemata zu einem Anstieg der minimalen Hemmkonzentration (MHK) des Arzneimittels geführt4. Das Auftreten Metronidazol-resistenter Stämme in vivo und in vitro kann ein Hinweis auf eine sich abzeichnende Arzneimittelresistenz sein. Allerdings sind die Studien zur Metronidazol-Resistenz und den damit verbundenen Mechanismen aus Indien sehr begrenzt5. Der Nachweis von Resistenzgenen aus klinischen Proben ohne reine Isolate kann bei epidemiologischen Studien zur Verteilung der Resistenzgene hilfreich sein. Darüber hinaus liefert die antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung durch Kulturmethoden nur Informationen über die Resistenzgene von Mikroorganismen, die unter bestimmten Bedingungen wachsen können.

Fälle von Behandlungsversagen auch nach adäquater Therapie aus verschiedenen Teilen der Welt weisen auf die Entwicklung einer klinischen Arzneimittelresistenz hin. Berichte über ein erneutes Auftreten von extraintestinalen Manifestationen von E. histolytica nehmen zu6,7,8,9. Es gibt Berichte über mehrfache Rückfälle und Behandlungsversagen trotz angemessener Behandlung6. Dennoch ist eine Resistenz gegen Metronidazol, obwohl bei Giardia lamblia, Trichomonas vaginalis und Leishmania donovani berichtet, im Fall von E. histolytica-Isolaten immer noch nicht dokumentiert10,11,12,13.

Bisher wurden zehn Nitroimidazol-Resistenzgene (nim A bis nim J) identifiziert, die zu einer verringerten Empfindlichkeit gegenüber 5-Nitroimidazol-Arzneimitteln führen14,15,16. Der vorgeschlagene Mechanismus für die Resistenz durch das Nim-Gen besagt, dass sie ein Enzym namens 5-Nitroimidazolreduktase kodieren, das die Bildung der Nitrosoradikale hemmt, die für die antimikrobielle Aktivität entscheidend sind17. Es wurde gezeigt, dass ein hohes Maß an Metronidazol-Resistenz leicht in Stämmen induziert werden kann, die das Nim-Gen enthalten15. Es wurde über eine erhöhte Häufigkeit des Nim-Gens auch nach kurzer Behandlung mit Metronidazol berichtet.

Seit 60 Jahren wurde kein neues Medikament gegen E. histolytica-Infektionen entwickelt, trotz der Dringlichkeit, die das Nationale Institut für Allergien und Infektionskrankheiten (NIAID) für die Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung von Krankheitserregern der Kategorie B gesetzt hat. In-vitro-Arzneimittelresistenzen bei Metronidazol stellen derzeit kein ernstes Problem dar, die zunehmenden Hemmkonzentrationen und Fälle von Behandlungsversagen lassen jedoch auf eine klinische Resistenz schließen6,7,8. Darüber hinaus sind mit der Langzeitanwendung von Metronidazol mehrere Nebenwirkungen verbunden, darunter Durchfall, Appetitverlust, metallischer Geschmack, die Auslösung genotoxischer Wirkungen, DNA-Schäden sowie oxidative Zellschäden3,18,19. Zu den kritischsten Reaktionen gehören Auswirkungen auf das Zentralnervensystem, periphere Neuropathie, Ataxie, Schwindel, Krämpfe und Kleinhirntoxizität20,21,22. Daher ist es wichtig, das Nutzen-Risiko-Verhältnis und die individuelle Anfälligkeit im Falle einer Metronidazol-Verschreibung zu überdenken.

Die Neubewertung verschiedener Heilpflanzen hinsichtlich ihrer therapeutischen Eigenschaften hat aufgrund der sich abzeichnenden Arzneimittelresistenz gegen die häufig verwendeten Wirkstoffe stark an Bedeutung gewonnen. Eine dieser Pflanzenarten ist Andrographis paniculata (A. paniculata). A. paniculata ist ein Heilkraut mit zahlreichen pharmakologischen Eigenschaften. Der reichhaltige therapeutische Nutzen dieser Pflanze wurde in den tropischen und subtropischen Regionen Südostasiens nachgewiesen23. Diese Regionen sind auch endemisch für Entamoeba-Infektionen, die zu erheblicher Morbidität und Mortalität führen24,25,26. Andrographolid ist die einzige Hauptverbindung, die aus A. paniculata isoliert wurde und deren zahlreiche medizinische Eigenschaften untersucht wurden. Neoandrographolid und Andrograpanin sind die anderen dominanten und wichtigen Diterpenoide, die aus dem oberirdischen Teil von A. paniculata isoliert wurden27. Unserer Erfahrung nach wurde kürzlich über eine signifikante anthelmintische Wirkung und die quantitative Abschätzung der Markerverbindungen in den Blattextrakten von A. paniculata bei menschlichen Hakenwurm-Isolaten berichtet28.

In unserem Tertiärversorgungszentrum haben wir zuvor die hohe Prävalenz von E. histolytica bei amöbischen Leberabszessen (ALA) und das hohe Wiederauftreten von ALA in einer zweijährigen Folgestudie untersucht8,29. Der Standort der vorliegenden Studie liegt im Gangesbecken, das in einem endemischen Nachbarland mit einer höheren Inzidenz von ALA in Verbindung gebracht wird. Die ungewöhnliche Rezidivrate könnte auf die allmähliche Entwicklung einer klinischen Resistenz gegen die in diesem geografischen Gebiet häufig verwendeten Arzneimittel hinweisen. Daher stellten wir die Hypothese auf, ob sich die klinische Resistenz gegen die Metronidazol-Behandlung in der Arzneimittelempfindlichkeitsprüfung von E. histolytica widerspiegelt. Vor diesem Hintergrund bestand das Ziel dieser Studie darin, die Arzneimittelanfälligkeit der klinischen Isolate von E. histolytica, die ALA verursachen, gegenüber Metronidazol und Tinidazol zu bewerten. Parallel dazu wurde die Analyse der Anti-Amöben-Aktivität der Wirkstoffe von A. paniculata (Andrographolid, Neo-Andrographolid und Andrographanin) durchgeführt. Aufgrund des Mangels an vorhandenen Daten wurde außerdem die Prävalenz des Metronidazol-Resistenzgens (Nim-Gen) in Stuhlproben von Krankenhauspatienten untersucht, um ein umfassendes Bild der aktuellen Situation der Arzneimittelresistenz bei E. histolytica zu erhalten.

Alle 15 in die Studie einbezogenen Leberaspirate erwiesen sich durch Nested-Multipex-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) für Entamoeba sp. als positiv für E. histolytica. Allerdings waren nur 2 (13,3 %) Stuhlproben dieser ALA-Patienten positiv für E. histolytica. Da wir zuvor über eine erhöhte Rezidivrate bei ALA-Patienten berichteten, erfolgte die Isolierung der Trophozoiten aus den Leberaspiratproben. Abbildung 1 zeigt das Vorhandensein der Trophozoiten in den Leberaspiratproben. Von den in die vorliegende Studie einbezogenen Durchfallproben waren 3 (3,3 %) Proben positiv für E. histolytica.

Mikroskopische Aufnahme der Trophozoiten in den Leberaspiratproben (40x).

Das Durchschnittsalter der ALA-Patienten betrug 41,06 ± 7,3 Jahre. Die Mehrheit (13/15, 86,6 %) der Teilnehmer waren Männer. In Anbetracht ihres Wohnorts stammten 9 (60 %) der Teilnehmer aus ländlichen Gebieten und 6 (40 %) aus städtischen Gebieten. Von der Gesamtzahl hatten 5 (33,3 %) Teilnehmer einen Hochschulabschluss (über der 5. Klasse), 7 (46,6 %) Teilnehmer verfügten über eine Grundschulbildung und 3 (20 %) hatten keinen Bildungsabschluss. Die Mehrheit (11/15, 73,3 %) der Teilnehmer war berufstätig. Fünf (33,3 %) Teilnehmer stammten aus einem niedrigen und 10 (66,6 %) Teilnehmer aus einem mittleren wirtschaftlichen Status. In der vorliegenden Studie trat ALA häufiger bei Männern mittleren Alters mit ländlichem Hintergrund auf. Aufgrund der Einbeziehung nur der erkrankten ALA-Fälle (keine Kontrollen) und der geringen Stichprobengröße der Studie wurde jedoch keine signifikante Korrelation zwischen den demografischen Faktoren und der Inzidenz der ALA gefunden.

Der mittlere IC50-Wert der E. histolytica-Isolate gegenüber Metronidazol und Tinidazol betrug 20,01 µM bzw. 16,1 µM. Die mittleren IC50-Werte waren für Metronidazol signifikant höher (p = 0,022) als für Tinidazol. Abbildung 2 zeigt die grafische Darstellung der mittleren prozentualen Hemmung der 15 klinischen Isolate von E. histolytica durch Metronidazol und Tinidazol. Wie aus Abb. 2 hervorgeht, war der Hemmungsprozentsatz von Tinidazol gegenüber den klinischen Isolaten von E. histolytica im gesamten in der Studie berücksichtigten Konzentrationsbereich höher als der von Metronidazol. Eine Liste von Studien mit Einzelheiten zur Arzneimittelempfindlichkeitsprüfung der E. histolytica-Isolate unter Verwendung verschiedener Tests ist in Tabelle 1 aufgeführt.

Prozentuale Hemmung klinischer E. histolytica-Isolate durch Metronidazol und Tinidazol.

Der mittlere IC50-Wert der E. histolytica-Isolate gegenüber den Wirkstoffen und dem Kontrollarzneimittel Metronidazol ist in Tabelle 2 aufgeführt. Andrographolid zeigte den minimalen mittleren IC50-Wert (3,06 µM) gegenüber den klinischen E. histolytica-Isolaten. Die grafische Darstellung des Vergleichs der mittleren prozentualen Hemmung der 15 klinischen Isolate von E. histolytica durch die Wirkstoffe und die Arzneimittel Metronidazol und Tinidazol ist in Abb. 3 dargestellt. Unter den Wirkstoffen zeigte Andrographolid die maximale prozentuale Hemmung, gefolgt von Neoandrographolid und Andrograpanin. Alle drei Wirkstoffe zeigten im Vergleich zu den üblicherweise verwendeten Nitroimidazolen eine bessere prozentuale Hemmung. Es wurde festgestellt, dass die Aktivitäten der Wirkstoffe im Vergleich zueinander nicht signifikant waren. Es gab jedoch eine signifikante prozentuale Hemmung der E. histolytica-Isolate durch Andrographolid im Vergleich zu Metronidazol (p = 0,0495).

Prozentuale Hemmung klinischer E. histolytica-Isolate durch Andrographolid, Neoandrographolid und Andrographanin im Vergleich zu Metronidazol und Tinidazol.

Keines der E. histolytica-Isolate zeigte das Vorhandensein des Nim-Gens. Bei Stuhlproben wurde festgestellt, dass die Prävalenz des Nim-Gens in Stuhlproben mit Durchfall und ohne Durchfall 76,6 % (69/90) bzw. 62,2 % (56/90) betrug. Die Prävalenz des Nim-Gens war in den Durchfallproben signifikant höher (p = 0,036). Unter den drei E. histolytica-positiven Durchfallproben zeigten 2 (66,6 %) Proben das Vorhandensein des Nim-Gens und von 87 E. histolytica-negativen Durchfallproben zeigten 67 (77 %) das Vorhandensein des Nim-Gens. Es wurde keine signifikante Korrelation zwischen dem Vorhandensein des Nim-Gens in den E. histolytica-positiven und -negativen Durchfallproben gefunden (p = 0,68).

Durch die Analyse der verdauten Fragmente beider Enzyme wurde festgestellt, dass alle für das Nim-Gen positiven Proben vom Nim-E-Typ waren. Die durch den Verdau mit den Restriktionsenzymen Hin1II und Taq1 erhaltenen Fragmente sind in Abb. 4 dargestellt. Die durch das Enzym Hin1II erhaltenen Restriktionsverdauungsprodukte zeigten ein einzelnes Fragment mit 441 bp und das Enzym Taq1 erzeugte zwei Fragmente mit 274 bp und 155 bp bei der Agarosegelelektrophorese .

Restriktionsverdauungsprodukte, erhalten durch (A) Hin1II-Enzym; 441 bp und (B) Taq1-Enzym; 274 bp und 155 bp.

Die Sequenzanalyse der Nim-Gen-PCR-Produkte bestätigte das Vorhandensein des Nim-E-Gentyps. Durch die BLAST-Analyse (Basic Local Alignment Search Tool) aus der verfügbaren Datenbank wurde eine Sequenzhomologie von 99 % mit dem Nim-E-Gentyp ermittelt. (Zugangsnummer: AM117602.1, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AM117602.1/).

Unter der mit Durchfallproben assoziierten Mikroflora war Prevotella (34, 37,7 %) vorherrschend, gefolgt von Bacteroides (20, 22,2 %), Escherichia coli (16, 17,7 %), Klebsiella (12, 13,3 %) und C. freundii (8, 8,8). %). Die Mehrheit (54, 78,2 %) der Durchfallproben, die das Vorhandensein des Nim-Gens zeigten, wiesen entweder das Vorhandensein von Prevotella oder Bacteroides auf.

Die Prüfung der Arzneimittelempfindlichkeit bei E. histolytica war aufgrund des Fehlens eines kompetenten Screening-Tests eine Herausforderung. Darüber hinaus sind die verfügbaren Methoden umfassend und erfordern komplexe Verfahren sowie Fachwissen und Einrichtungen zur Parasitenkultur30. Daher liegen nur wenige Studien vor, die über die Arzneimittelsensitivität von E. histolytica-Isolaten berichten.

Der interessanteste Punkt war, dass die Ergebnisse der vorliegenden Studie zwar mit den vorherigen Berichten übereinstimmten, die mittleren IC50-Werte in der vorliegenden Studie jedoch höher waren als in früheren Studien10,31. Eine 18 Jahre zuvor in Indien durchgeführte Studie zur Arzneimittelsensitivität der E. histolytica-Isolate hatte einen mittleren IC50-Wert von 13,2 µM bzw. 12,4 µM für Metronidazol und Tinidazol ergeben10. Der Anstieg der mittleren IC50-Werte kann auf das Auftreten einer klinischen Resistenz oder auf Unterschiede in den Kulturtechniken des Parasiten, den beteiligten Stämmen oder den verwendeten Rohstoffen zurückgeführt werden. In Studien wurde für die im Labor passagierten E. histolytica-Stämme eine minimale MHK von 12,5–25 µM angegeben. In einer anderen Studie wurde ein mittlerer IC50-Wert von 18,47 µM und ein Grenzwert von > 30 µM für die Resistenz in den E. histolytica-Isolaten beschrieben32. Allerdings sind die meisten Studien zur Arzneimittelsensitivität von E. histolytica veraltet und es liegen nur wenige aktuelle Daten zu den häufig verwendeten Antiamöbenmitteln vor. Darüber hinaus wird der Vergleich der verfügbaren Studien zur Arzneimittelsensitivität von E. histolytica insbesondere aufgrund der unterschiedlichen Methoden zur Messung der Arzneimittelaktivität schwierig.

Verschiedene Studien haben die Empfindlichkeit der Medikamente gegenüber den E. histolytica-Isolaten im Hinblick auf minimale letale Konzentration (MLC), MHK, IC50, effektive Dosis 50 (ED50) usw. berichtet32,33,34,35. Es wurde jedoch vorgeschlagen, die Empfindlichkeit eines Arzneimittels als molare Konzentration (µM) anzugeben, um den Vergleich der Wirksamkeit der Arzneimittel zu standardisieren, insbesondere in Fällen, in denen Metronidazol mit anderen Nitroimidazolen mit deutlich höherem Molekulargewicht verglichen wird31. Die in die vorliegende Studie einbezogenen klinischen Isolate wurden in der monoxenischen Kultur gehalten, da zuvor berichtet wurde, dass das Vorhandensein der Bakterienflora zusammen mit der Amöbe die Leistung des Tests oder die Empfindlichkeitswerte nicht wesentlich beeinträchtigte10,36.

Die prozentuale Hemmung der klinischen E. histolytica-Isolate durch den Markerwirkstoff Andrographolid war signifikant höher als durch das Kontrollarzneimittel Metronidazol. Berichten zufolge besitzen Andrographolid und seine Analoga einen neuartigen Wirkmechanismus, der für ihre Wirkung verantwortlich ist37. Eine kürzlich durchgeführte Studie mit Nanopartikeln auf Andrographolid-Basis hat gezeigt, dass sie intrazelluläre reaktive Sauerstoffspezies erzeugen, die die Schädigung lebenswichtiger Biomoleküle, einschließlich DNA, Proteine ​​und Lipide, fördern und Membranlecks verursachen, die zur Freisetzung der zytoplasmatischen Komponenten und zum Tod führen38.

Bei dem Malariaparasiten zeigte Andrographolid eine hemmende Wirkung auf das Ringstadium des Parasiten und beeinflusste die Protein- und Nukleinsäuresynthese. Andrographolid wurde als „Transkriptionsblocker“ beim Parasiten Plasmodium falciparum39 bezeichnet. Bei dem mit Andrographolid behandelten Filarienparasiten wurde festgestellt, dass die Aktivität der antioxidativen Enzyme und der Glutathion-S-Transferase (GSH) konzentrationsabhängig verringert ist40. Darüber hinaus wurde bei mit Andrographolid behandelten Parasiten ein Anstieg der Aktivität der NADPH-Oxidase beobachtet, der zur Entwicklung von Wasserstoffperoxid (H2O2) und anderen gefährlichen reaktiven Sauerstoffspezies führt, die die mitochondriale Membranorganisation spalten40. Obwohl sich Andrographolid als traditionelles Arzneimittel bei Ruhr als wirksam erwiesen hat, fehlt eine detaillierte Studie über die genaue Wirkungsweise von Andrographolid bei E. histolytica.

In der vorliegenden Studie wurde das Nim-Gen in keinem der klinischen Isolate von E. histolytica nachgewiesen. Die vorliegende krankenhausbasierte Studie ergab jedoch eine hohe Prävalenz des Nim-Gens in den Durchfall- und Nicht-Durchfall-Stuhlproben der Patienten. Bei anderen anaeroben Mikroorganismen, wie z. B. klinischen Isolaten von Bacteroides spp. und Prevotella spp. Es wurde eine Beförderungsrate von 0–2,8 % bzw. 0–8 % angegeben17,41,42,43. Es liegen keine Daten zum Vorhandensein von Nim-Genen in klinischen Isolaten von E. histolytica vor, die eine Stellungnahme zu diesem Studienergebnis abgeben könnten. Es ist bekannt, dass die mit dem Nim-Gen verbundene Metronidazol-Resistenz je nach geografischer Region unterschiedlich ist44. In der vorliegenden Studie scheint die verringerte Anfälligkeit der klinischen Isolate von E. histolytica gegenüber häufig verwendeten Nitroimidazolen nicht mit den Nim-Genen verbunden zu sein. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Verringerung der Empfindlichkeit gegenüber Metronidazol bei den E. histolytica-Isolaten auf mehrere Faktoren zurückzuführen sein kann, von denen einige nicht enzymatisch sind45. Die erhöhte Expression von Eisen-Superdismutase (Fe-SOD) und Peroxiredoxin stellt zusammen mit der verminderten Expression von Ferredoxin1 und TrxR eine wichtige Komponente dar, die am Mechanismus der Metronidazolresistenz bei E. histolytica beteiligt ist46.

Die hohe Prävalenz des Nim-Gens in Stuhlproben von Patienten, die das Tertiärversorgungszentrum aufsuchen, steht im Einklang mit einer anderen Studie aus Indien, die eine hohe Kopienzahl des Nim-Gens in Stuhlproben von Patienten mit Magen-Darm-Beschwerden sowie bei gesunden Personen zeigte aus der Community47. Eine solch hohe Prävalenz des Nim-Gens in dieser geografischen Region kann auf den OTC-Verkauf von Nitroimidazolen (insbesondere Metronidazol) zurückgeführt werden, der mit der erhöhten Häufigkeit der Nim-Gen-Induktion in Verbindung gebracht wird48. Außerdem wurde festgestellt, dass das Vorhandensein des Nim-Gens signifikant mit den Durchfall-Stuhlproben assoziiert ist (p = 0,036). Dies könnte an der erheblichen Häufigkeit von Mikroorganismen wie Bacteroides spp. liegen, die das Nim-Gen tragen. und Prevotella spp. in den Durchfallstuhlproben49,50.

In der vorliegenden Studie wurde über das Vorhandensein des Nim-E-Gentyps in allen positiven Proben berichtet. Unser Befund steht im Einklang mit früheren Studien aus Indien, in denen beschrieben wurde, dass Nim E der am häufigsten in dieser geografischen Region zirkulierende Nim-Gentyp ist 5,47,51. Im Gegensatz zu unseren Ergebnissen haben Studien aus anderen Teilen der Welt gezeigt, dass das Nim-A-Gen, gefolgt vom Nim-B- und Nim-D-Gen, der am weitesten verbreitete Typ ist14,15. Allerdings wurde in der Literatur noch nie ein möglicher Zusammenhang zwischen der Art des Nim-Gens und dem Grad der Resistenz beschrieben.

Der Zweck der vorliegenden Arbeit bestand darin, das Anfälligkeitsmuster der klinischen Isolate von E. histolytica gegenüber den häufig verwendeten Arzneimitteln zu analysieren. Darüber hinaus wurde die Anti-Amöben-Eigenschaft der Markerverbindungen von A. paniculata untersucht. Nach unserem besten Wissen ist dies der erste Bericht über die Anti-Amöben-Aktivität der Wirkstoffe aus den Extrakten der Blätter von A. paniculata gegenüber den klinischen Isolaten von E. histolytica. Eine detaillierte Untersuchung des Toxizitätsprofils, der Dosisbestimmung und der Verabreichungsmöglichkeiten der Wirkstoffe ist erforderlich, um sie in Zukunft als wirksames Anti-Amöben-Mittel zu etablieren.

Die Studie war nicht ohne Einschränkungen, da aufgrund der Schwierigkeit bei der Etablierung und Aufrechterhaltung der Parasitenkultur nur 15 klinische Isolate von E. histolytica in die Studie einbezogen wurden. Die Arzneimittelempfindlichkeitstests konnten in der axenischen Kultur aufgrund fehlender Kultur- und Wartungseinrichtungen nicht durchgeführt werden. Darüber hinaus wurde der Arzneimittelempfindlichkeitstest nur mit zwei Arzneimitteln durchgeführt: Metronidazol und Tinidazol. Diese Medikamente stellen jedoch die Hauptbehandlungslinie für E. histolytica-Infektionen, einschließlich ALA-Fällen, dar und liefern daher wichtige Einblicke in die Situation.

Die Studie wurde von der Ethikkommission des Instituts, Fakultät für Medizin, Institut für Medizinische Wissenschaften, Banaras Hindu University (Dean/2016–17/EC/045) ethisch genehmigt. Alle Experimente in der vorliegenden Studie wurden gemäß den Richtlinien und Vorschriften der Ethikkommission des Instituts durchgeführt. Die Studie umfasste nur Erwachsene und alle teilnehmenden Probanden erhielten eine schriftliche Einverständniserklärung, nachdem ihnen der Zweck der Studie erläutert worden war.

In die vorliegende Studie wurden Patienten mit gut definierten Leberabszessen von mehr als 5 cm Durchmesser einbezogen, die durch Ultraschall des Abdomens bestätigt wurden. Patienten, bei denen zuvor eine Aspiration aufgetreten war oder die in den letzten vier Wochen Medikamente eingenommen hatten, wurden von der Studie ausgeschlossen. Darüber hinaus wurden Leberaspirate, die entweder durch aerobe Kultur oder durch molekularen Nachweis durch 16-S-rRNA-Primer das Vorhandensein assoziierter Bakterien zeigten, von der Studie ausgeschlossen52.

In diese Studie wurden 15 Isolate aus 15 E. histolytica-positiven ALA-Proben von Patienten der Abteilung für Gastroenterologie und Radiologie des Sir Sunderlal Hospital in Varanasi, Indien, einbezogen. Da die Trophozoiten größtenteils an der Wand des Abszesses haften, wurde eine Reihe kleinerer Flaschen zum Sammeln des Leberaspirats verwendet, um die letzte Fraktion unverdünnt durch die Hauptmasse des Materials zu halten53.

Die Stuhlproben dieser ALA-Patienten wurden ebenfalls gesammelt. Ein vorab getesteter Fragebogen zu den demografischen Details wie Alter, Geschlecht, Wohnort, Bildung, Beschäftigung und wirtschaftlichem Status der Patienten wurde von erfahrenen Forschungswissenschaftlern zusammengestellt.

Darüber hinaus wurden Stuhlproben von Patienten mit Durchfall (n = 90) und ohne Durchfall (n = 90) in verschiedenen ambulanten Abteilungen des Sir Sundarlal Hospital in Varanasi einbezogen, um die Häufigkeit der Nim-Gene in dieser geografischen Region zu ermitteln. Alle Durchfallproben wurden auf das Mac-Conkey-Agar-Medium und das Blut-Agar-Medium geimpft und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Zusätzlich wurde in den Durchfallproben ein Screening auf häufig vorkommende Anaerobier aus früherer Literatur mittels konventioneller PCR29 durchgeführt.

Für alle Proben wurde eine direkte Mikroskopie durch Nassmontage durchgeführt, um das Vorhandensein von Trophozoiten von Entamoeba spp. zu überprüfen. Für den molekularen Nachweis von E. histolytica in allen Proben wurde eine verschachtelte Multiplex-PCR unter Verwendung artspezifischer Primer durchgeführt, die auf 16S wie das rRNA-Gen abzielen54. Die Vorbereitung der Reaktionsmischung und die Reaktionsbedingungen waren wie zuvor beschrieben29.

Trophozoiten wurden aus Leberaspiraten von ALA-Patienten durch Kultur in modifiziertem Boeck- und Drbohlav-Monoxenmedium mit wenigen Modifikationen isoliert53,55. Locke-Ei-Medium wurde vorbereitet. Hierzu wurde Lockes Lösung durch Auflösen von 8,0 g Natriumchlorid (Sigma-Aldrich Chemicals Pvt. Ltd, Indien), 0,2 g Calciumchlorid (Sigma-Aldrich Chemicals Pvt. Ltd, Indien), 0,2 g Kaliumchlorid (Sigma-Aldrich Chemicals Pvt. Ltd, Indien) hergestellt Chemicals Pvt. Ltd, Indien), 0,01 Magnesiumchlorid (Sigma-Aldrich Chemicals Pvt. Ltd, Indien), 2,0 g Natriumphosphat (Sigma-Aldrich Chemicals Pvt. Ltd, Indien), 0,4 g Natriumbicarbonat (Sigma-Aldrich Chemicals Pvt. Ltd, Indien) und 0,3 g Kaliumphosphat, einbasisch (Sigma-Aldrich Chemicals Pvt. Ltd, Indien) in 1 l destilliertes Wasser. Die Locke-Lösung wurde 15 Minuten lang bei 121 °C und einem Druck von 15 lb/in2 autoklaviert. Eventuell gebildeter Niederschlag wurde durch Filtration mit Whatman Nr. entfernt. 1 Papier.

Für die Eierschnittzubereitung wurden frische Hühnereier durch Abflammen in 70 %igem Ethanol sterilisiert und in einen Messzylinder geschlagen. Locke-Lösung (12,5 ml) pro 45 ml Ei wurde zugegeben und dann in einem Waring-Mischer emulgiert und durch Gaze in einen Kolben filtriert. Insgesamt 5 ml des emulgierten Eies wurden in Standardkulturröhrchen (16 x 125 mm) gegeben und durch Inspizieren sterilisiert. Nach dem Abkühlen der Schrägen wurden diese mit 6 ml Locke-Lösung überschichtet.

Vor der Zugabe der Proben wurden dem Medium deaktiviertes Rinderserum (Biological Industries, Kibbuz Beit-Haemek, Israel) und sterilisierte Reisstärke (VWR International, Poole, Vereinigtes Königreich) zugesetzt56. Darüber hinaus wurde vor der Zugabe der klinischen Probe eine Öse voller reiner Kolonien von Klebsiella pneumoniae, die gegenüber Metronidazol empfindlich waren, in die Kulturröhrchen geimpft. Die Subkultivierung wurde alle 48 Stunden durchgeführt und die Trophozoiten wurden meist nach zwei Passagen einem weiteren Arzneimittelempfindlichkeitstest unterzogen.

Die reinen Salze des Arzneimittels Metronidazol und Tinidazol wurden in die Studie einbezogen (Sigma-Aldrich Chemicals Pvt. Ltd, Indien). Es wurde ein Konzentrationsbereich von 0,78 µM bis 100 µM verwendet. Andrographolid (CAS-Nr. 5508–58–7, Reinheit > 95 %), Neoandrographolid (CAS-Nr. 27215–14–1, Reinheit > 95 %) und Andrographanin (CAS-Nr. 82209–74–3, Reinheit > 95 % ) wurden von Natural Remedies Pvt. bezogen. Ltd (Bangalore, Indien) hergestellt und in einer Konzentration von 0,19 µM–100 µM verwendet.

Für den Empfindlichkeitstest wurde Robinson-Medium für Entamoeba-Doppelpack (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd, Mumbai, Indien) verwendet. Die Empfindlichkeitsprüfung gegenüber den Standardarzneimitteln und den Wirkstoffen wurde wie zuvor beschrieben10 durchgeführt. Kurz gesagt, die Trophozoiten wurden aus einer 24 Stunden alten Kultur an der Grenzfläche zwischen der Locke-Lösung und der Eischräge geerntet und die Anzahl wurde auf 1 × 105 Trophozoiten pro ml eingestellt. Der In-vitro-Empfindlichkeitstest wurde in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Um die erforderlichen Konzentrationen zu erhalten, wurden Verdünnungen der Arzneimittel und Wirkstoffe verdoppelt. Verdünnte Trophozoitensuspension wurde zugegeben und die Platten wurden 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Inhalt der Platte verworfen und die Platte gewaschen. Darüber hinaus wurden 100 µl Nitroblau-Tetrazolium (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd, Mumbai, Indien) in jede Vertiefung gegeben und die Platten wurden 45 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten erneut gewaschen und DMSO (200 µl/Vertiefung) zugegeben. Anschließend wurden die Platten 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die optische Dichte (OD) gemessen. Jedes Isolat wurde im Duplikat gegen die Arzneimittel und Wirkstoffe getestet. Jeder Test umfasste eine Kontrollvertiefung, die nur Medien und die Trophozoiten ohne Medikamente enthielt, sowie eine Leervertiefung, die nur Medien enthielt. Die Messung der OD in jedem Test erfolgte bei 540 nm mit einem Mikrotiterplattenlesegerät (LisaScan® EM Elisa-Plattenlesegerät, Transasia Bio-Medicals Ltd, Indien). Der Prozentsatz nicht lebensfähiger Trophozoiten bei jeder Konzentration wurde anhand der Formel berechnet:

Die mittleren IC50-Werte für alle klinischen Isolate gegen die Medikamente (Metronidazol, Tinidazol) und die Wirkstoffe (Andrographolid, Neoandrographolid und Andrographanin) wurden mit dem „Quest Graph™ IC50 Calculator“ (AAT Bioquest, Inc.) berechnet.

Die 15 E. histolytica-Isolate und Stuhlproben von Patienten mit und ohne Durchfall wurden auf das Vorhandensein von Nim-Genen untersucht. Die DNA-Extraktion wurde aus allen Isolaten und Stuhlproben mit dem QIAGEN Stool Mini Kit (Qiagen, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

Der Nachweis von Nim-Genen in den E. histolytica-Isolaten und Stuhlproben erfolgte durch konventionelle PCR unter Verwendung des universellen Primersatzes Nim-3 und Nim-5 für alle bekannten Nim-Gene57.

Die Bestimmung des Nim-Gentyps erfolgte durch Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP). Die im vorherigen Schritt erhaltenen PCR-Produkte wurden mit den beiden Restriktionsenzymen Taq1 (New England Biolabs, Massachusetts, USA) und Hin1II (New England Biolabs, Massachusetts, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers verdaut15,58. Zur Bestätigung des Nim-Gentyps wurden die PCR-Produkte einer DNA-Sequenzierung der Teilregion des SSU-rRNA-Gens unterzogen.

Der mittlere IC50-Wert der klinischen Isolate von E. histolytica wurde mit dem Student-T-Test unter Verwendung der MedCalc-Software 2019 (Version:bv) verglichen. Das Vorhandensein des Nim-Gens in Durchfall- und Nicht-Durchfall-Stuhlproben wurde auch mit der MedCalc-Software 2019 (Version:bv) verglichen. Bei den Wirkstoffen wurde Metronidazol als Kontrollarzneimittel eingesetzt. Ein p-Wert < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Alle während der Studie generierten oder analysierten Daten wurden in das Manuskript aufgenommen.

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Die Autoren danken der Banaras Hindu University und dem Department of Science and Technology (DST), Indien, für die Bereitstellung der Möglichkeit zur Durchführung dieser Studie. Die Autoren danken der Jawaharlal Nehru University (Structural Biology Lab), Neu-Delhi, für die Demonstration von Kulturtechniken. Die Autoren möchten außerdem Dr. Satyanshu Kumar, DMAPR, Anand Gujarat für die Einführung in die Heilpflanzen danken. Die Autoren danken den Teilnehmern auch für die Bereitstellung von Proben für die Studie.

Abteilung für Mikrobiologie, Institut für medizinische Wissenschaften, Banaras Hindu University, Varanasi, 221005, Indien

Aradhana Singh & Tuhina Banerjee

Abteilung für Gastroenterologie, Institut für medizinische Wissenschaften, Banaras Hindu University, Varanasi, 221005, Indien

Sunit Kumar Shukla

Abteilung für Biowissenschaften, Banasthali Vidyapeeth, Jaipur, 302001, Indien

Soumya Upadhyay

Abteilung für Radiodiagnostik und Bildgebung, Institut für medizinische Wissenschaften, Banaras Hindu University, Varanasi, 221005, Indien

Ashish Verma

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AS: Methodik; Formale Analyse; Untersuchung; Schreiben – Originalentwurf TB: Konzeptualisierung; Methodik; Ressourcen; Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten; Aufsicht SKS: Aufsicht; Ressourcen SU: Untersuchung AV: Ressourcen.

Korrespondenz mit Tuhina Banerjee.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Singh, A., Banerjee, T., Shukla, SK et al. Anstieg der Nitroimidazol-Hemmkonzentration bei den Entamoeba histolytica-Isolaten, was zu amöbischem Leberabszess führt, und Screening von Andrographolid als zweckentfremdetes Medikament. Sci Rep 13, 12192 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39382-1

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Eingegangen: 19. Januar 2023

Angenommen: 25. Juli 2023

Veröffentlicht: 27. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39382-1

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