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Jul 31, 2023

MenT-Nukleotidyltransferase-Toxine verlängern tRNA-Akzeptorstämme und können durch asymmetrische Antitoxinbindung gehemmt werden

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4644 (2023) Diesen Artikel zitieren 1087 Zugriffe 21 Altmetric Metrics-Details Mycobacterium tuberculosis, das Bakterium, das für menschliche Tuberkulose verantwortlich ist,

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4644 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Mycobacterium tuberculosis, das für die menschliche Tuberkulose verantwortliche Bakterium, verfügt über ein Genom, das eine bemerkenswert große Anzahl von Toxin-Antitoxin-Systemen mit weitgehend unbekannter Funktion kodiert. Wir haben kürzlich gezeigt, dass das Genom von M. tuberculosis vier einer weit verbreiteten MenAT-Familie von Nukleotidyltransferase-Toxin-Antitoxin-Systemen kodiert. In dieser Studie charakterisieren wir MenAT1 mithilfe der tRNA-Sequenzierung, um die MenT1-tRNA-Modifikationsaktivität zu demonstrieren. Die MenT1-Aktivität wird durch MenA1 blockiert, ein kurzes Protein-Antitoxin, das nichts mit der MenA3-Kinase zu tun hat. Die röntgenkristallographische Analyse zeigt eine Blockierung der konservierten MenT-Faltung durch asymmetrische Bindung von MenA1 über zwei MenT1-Protomere, wodurch ein heterotrimerer Toxin-Antitoxin-Komplex entsteht. Schließlich demonstrieren wir auch die tRNA-Modifikation durch das Toxin MenT4, was auf eine konservierte Aktivität in der gesamten MenT-Familie hinweist. Unsere Studie beleuchtet die Variation der tRNA-Zielpräferenzen durch MenT-Toxine, die selektive Verwendung von Nukleotidsubstraten und verschiedene Arten der MenA-Antitoxinaktivität.

Toxin-Antitoxin (TA)-Systeme bestehen aus kleinen genetischen Modulen, die ein schädliches Toxin und sein antagonistisches Antitoxin kodieren. Sie sind im gesamten Genom von Bakterien und Archaeen sowie auf mobilen genetischen Elementen weit verbreitet und im Allgemeinen durch Stress induzierbar1,2,3,4,5. TA-Systeme spielen eine Rolle bei der Abwehr von Phageninfektionen, der Aufrechterhaltung genomischer Regionen und tragen in einigen Fällen zur bakteriellen Virulenz und Antibiotika-Persistenz bei4,6,7,8,9. Es hat sich gezeigt, dass unter milden Wachstumsbedingungen die Toxinaktivität durch das entsprechende Antitoxin blockiert wird und das Bakterienwachstum nicht beeinträchtigt wird. Unter bestimmten Bedingungen wie einer Phageninfektion oder einem Plasmidverlust ist das Gleichgewicht von Toxin und Antitoxin jedoch gestört. Infolgedessen zielen freie Toxine auf wesentliche zelluläre Prozesse oder Strukturen ab, darunter Translation, Replikation, Metabolismus oder die Zellhülle, und verursachen Wachstumshemmung oder Zelltod2,10.

Mycobacterium tuberculosis, das für menschliche Tuberkulose verantwortliche Bakterium, verfügt über ein Genom, das eine bemerkenswerte Häufigkeit von über 86 TA-Systemen kodiert11,12. Diese Suite von TA-Systemen umfasst mehrere Beispiele aus gut konservierten TA-Familien, von denen im Allgemeinen gezeigt wurde, dass sie unter relevanten Stressbedingungen induziert werden, einschließlich Hypoxie, Makrophageneinschluss oder Exposition gegenüber Antibiotika13,14. Viele der mutmaßlichen M.-tuberculosis-Toxine erwiesen sich bei Expression in M. tuberculosis, M. smegmatis und/oder E. coli als toxisch, während ihre schädliche Wirkung durch die Koexpression des entsprechenden Antitoxins wirksam gehemmt wurde13,15. Dementsprechend wurde vorgeschlagen, dass aktivierte Toxine unter bestimmten Bedingungen das Wachstum von M. tuberculosis modulieren und so zum Überleben im menschlichen Wirt beitragen könnten11,15,16. Doch abgesehen von einer Handvoll TA-Systemen, die getestet wurden und nachweislich zur Wirtsinfektion beitragen17,18,19, ist ihre zelluläre Funktion noch weitgehend unbekannt. Darüber hinaus lässt die hochtoxische Natur einiger dieser Toxine darauf schließen, dass ihre antibakteriellen Mechanismen zur Identifizierung neuer Angriffspunkte für Arzneimittel oder alternativ zur direkten Anwendung als intrazelluläre antimikrobielle Mittel genutzt werden könnten20,21,22,23,24.

Mitglieder der MenAT-Familie der TA-Systeme in M. tuberculosis kodieren ein Toxin mit einer konservierten Nukleotidyltransferase (NTase)-ähnlichen Proteindomäne (DUF1814) und ein zugehöriges Antitoxin, das zu verschiedenen Proteinfamilien gehören kann25,26. Unter den Mitgliedern der MenAT-Familie von M. tuberculosis wurde gezeigt, dass MenT1 (Rv0078A), MenT3 (Rv1045) und MenT4 (Rv2826c) das Wachstum von M. smegmatis bei Überexpression hemmen, während MenT2 (Rv0836c) keine nachweisbare Wirkung zeigte25. MenT-Toxine gehören zur Familie der abortiven Infektionsproteine ​​(AbiEii) von Streptococcus agalactiae, die vier konservierte Signaturmotive enthalten26. Die N-terminalen Motive I und II kommen in der DNA-Polymerase β vor und sollen ein Metallion für die Nukleotidbindung und -übertragung koordinieren. Das C-terminale Motiv III ähnelt dem von tRNA-NTasen, die das 3ʹ-CCA-Motiv zu unreifen tRNAs hinzufügen, und könnte für die Basenstapelung mit Substraten wichtig sein. Das C-terminale Motiv IV ist einzigartig für DUF1814-Proteine ​​und bildet vermutlich eine katalytische Stelle mit Motiv III26,27. Bis heute ist das MenT3-Toxin das am besten charakterisierte Mitglied dieser Familie. Es wurde gezeigt, dass MenT3 (auch TglT genannt) die Translation hemmt, indem es Pyrimidine auf das 3ʹ-CCA-Ende von tRNA-Akzeptorstämmen überträgt (in vitro bevorzugt auf Ser-tRNA) und so eine weitere Aminoacylierung verhindert25. Bemerkenswerterweise wurde angenommen, dass diese Aktivität durch das MenA3-Antitoxin neutralisiert wird, das als spezifische Kinase fungiert und MenT3 am Rest der katalytischen Stelle von Ser78 phosphoryliert27. Diese vorgeschlagene Art der Hemmung führte zur Klassifizierung von MenAT3 als Typ-VII-TA-System3,28. Die Röntgenstrukturen von MenT3 und MenT4 zeigen, dass es sich bei beiden um monomere, zweilappige kugelförmige Proteine ​​handelt, die Ähnlichkeit in ihrer Gesamtfaltung aufweisen, insbesondere in ihrem mutmaßlichen aktiven Zentrum25. Darüber hinaus zeigen die Strukturen des Antitoxins MenA4 und des engen Homologen AbiEi das Vorhandensein von N-terminalen geflügelten Helix-Turn-Helix-DNA-Bindungsdomänen, die über einen kurzen Linker mit C-terminalen Kinasedomänen verbunden sind, die an der Toxinneutralisierung beteiligt sind29,30,31. In vivo wurde gezeigt, dass menAT2 bei Exposition gegenüber nitrosativem Stress induziert wird und für die Pathogenese von M. tuberculosis bei Meerschweinchen erforderlich ist32. Im Gegensatz dazu ist über MenAT1 praktisch nichts bekannt. Das MenAT1-System kodiert für das erwartete NTase-ähnliche Toxinprotein MenT1 (das 15 % der Aminosäureidentität mit MenT3 teilt) zusammen mit einem sehr kurzen mutmaßlichen Antitoxin von 68 Aminosäuren namens MenA1, das ursprünglich als mutmaßliches SymE-ähnliches Typ-I-Toxin identifiziert und vorhergesagt wurde ungeordnet sein und keine DNA-bindende Domäne besitzen12. Frühere Arbeiten zeigten, dass MenT1 toxisch ist, wenn es in M. smegmatis exprimiert wird, und dass seine Toxizität durch co-überexprimiertes MenA125 wirksam gehemmt wurde. Interessanterweise zeigte die Überexpression von MenT1 keine nachweisbare Toxizität in E. coli, was in scharfem Gegensatz zu MenT3 oder AbiEii25,33 steht.

In dieser Arbeit haben wir die biochemische Aktivität, Struktur und Antitoxizität von MenAT1 untersucht. Wir zeigen, dass MenAT1 in vivo in seinem nativen Wirt M. tuberculosis als echtes TA-System fungieren kann. Darüber hinaus fungiert das Toxin MenT1 in vitro als tRNA-NTase, die CMPs an das 3ʹ-Ende von tRNA-Akzeptorstämmen überträgt, ohne spezifische tRNAs zu bevorzugen. Die biochemische Aktivität von MenT1 wurde durch gereinigtes MenA1 vollständig gehemmt. Wir präsentieren die gelöste Kristallstruktur von MenT1 allein und im Komplex mit seinem kleinen Protein-Antitoxin MenA1. Das MenA1-Monomer verhindert die MenT1-Toxizität, indem es asymmetrisch an identische Flächen zweier MenT1-Protomere bindet und so die aktiven Zentren von MenT1 blockiert. Schließlich zeigen wir, dass MenT4 auch keine starke Präferenz für spezifische tRNA zeigt, was auf eine konservierte Art der Toxizität in der weit verbreiteten MenT-Familie hinweist.

Obwohl MenT-Toxine durch das Vorhandensein ihrer DUF1814-NTase-Domäne identifiziert werden können, sind MenA-Antitoxine vielfältiger und zeigen keinen nachweisbaren Crosstalk mit nicht verwandten MenT-Toxinen25. Ob eine solche Diversität in MenAT-Paarungen unterschiedliche antitoxische Mechanismen widerspiegelt, bleibt unbekannt25,27,29. MenA1, kodiert durch rv0078B, ist ein kleines Protein mit 68 Aminosäuren, das offenbar keine DNA-Bindungsdomäne kodiert. Innerhalb von H37Rv wird rv0078B in einer „atypischen Genomregion“ gefunden, was darauf hindeutet, dass es möglicherweise durch horizontalen Gentransfer bei einem Vorfahren von M. tuberculosis erworben wurde34. Die Analyse des Vorhandenseins von MenA1-Homologen in Bakteriengenomen mithilfe von FlaGs35 ergab, dass von den 21 identifizierten menA1-Genen 15 stromaufwärts eines menT-ähnlichen offenen Leserahmens lokalisiert waren, während die anderen unbekannte Gene waren (Abb. 1A, Abb. S1, Ergänzendes Datenblatt 1). Sequenzvergleiche der identifizierten MenT1- und MenA1-Homologen zeigen die Erhaltung von Strukturelementen und mutmaßlichen Resten des aktiven Zentrums (Abb. S2). Obwohl MenAT1 in allen Genomen von M. tuberculosis konserviert ist, ist nichts über seine Funktionalität in diesem Bakterium bekannt. Daher haben wir das menAT1-Operon in M. tuberculosis H37Rv gelöscht und die Toxizität (Expression von menT1 allein) und die Toxizitätsrettung (menAT1-Operon) sowohl in den Deletionsmutanten- als auch in den Wildtyp-Stämmen (WT) überwacht (Abb. 1B). Die Ergebnisse zeigen, dass MenT1 tatsächlich in der Lage ist, das Wachstum von M. tuberculosis effizient zu hemmen, und dass eine solche schädliche Wirkung durch menA1, das entweder auf dem Chromosom (H37Rv WT) oder auf einem integrativen Plasmid (H37Rv ΔmenAT1) vorhanden ist, wirksam neutralisiert wurde. Diese Daten zeigen, dass MenAT1 ein echtes TA-System bei M. tuberculosis ist.

Eine Erhaltung der Gennachbarschaften und phylogenetische Maximum-Likelihood-Analysen wurden verwendet, um die Verteilung von menA1-Genen zu untersuchen (durchgeführt mit FlaGs, http://www.webflags.se/). Das menA1-Gen ist blau hervorgehoben und nicht konservierte Gene sind nicht gefärbt. Die Gene, die für Proteine ​​kodieren, die zu einem homologen Cluster in mehr als einer Genomnachbarschaft gehören, werden durch Farbe angezeigt (siehe ergänzendes Datenblatt 1 zur Identifizierung von Clustern und ihren entsprechenden flankierenden Proteinzugangsnummern). Unter den am stärksten konservierten benachbarten Proteinen entspricht (2) Rv0078, einem bekannten Repressor von menTA1, (3) Rv0077c einer mutmaßlichen Oxidoreduktase, (8) Rv0079 einem unbekannten Gen des Ruheregulons, (11) einem mutmaßlichen LysR-Transkriptionsregulator, (4) zu einer P-Loop-NTPase enthaltenden Domäne und (10) zu einer Rifampin-ADP-Ribosyltransferase. Die vollständigen Namen der Bakterienarten sind in Abb. S1 aufgeführt. B M. tuberculosis H37Rv oder sein mutierter Stamm Δ(menA1-menT1)::ZeoR wurde mit dem pGMC-Vektor, pGMC-menT1 oder pGMC-menAT1 transformiert. Nach der phänotypischen Expression wurde die Hälfte des Transformationsmixes auf 7H11-OADC-Platten mit Sm ausplattiert, und die andere Hälfte wurde auf 7H11-OADC-Sm-Platten ausplattiert, die mit 200 ng.ml−1 Atc-Induktor ergänzt waren. Die Platten wurden 20 Tage lang bei 37 °C inkubiert. Die präsentierten Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente.

Um die MenT1-Funktion weiter zu untersuchen, haben wir zunächst die röntgenkristallographische Struktur von MenT1 allein mit einer Auflösung von 1,65 Å bestimmt (Abb. 2A, Tabelle 1, Abb. S3). Die MenT1-Struktur stellt ein zweilappiges globuläres Protein dar, mit einer oberen Domäne, die aus einem siebensträngigen β-Faltblatt besteht, das auf beiden Seiten mit zwei α-Helices dekoriert ist und durch einen kurzen Linker mit einer zweiten Domäne verbunden ist, die aus vier α-Helices besteht Bündel (Abb. 2A). Die Oberflächenelektrostatik zeigt starke Unterschiede auf beiden Seiten des Proteins, mit einem ausgeprägten elektropositiven Hohlraum auf einer Seite (Abb. 2B). Wir führten sequenzunabhängige Strukturüberlagerungen von MenT1 unter Verwendung unserer zuvor gelösten Strukturen der Toxine MenT3 (PDB: 6Y5U) und MenT4 (PDB: 6Y56) durch. Die Überlagerung von MenT1 mit MenT3 ergab eine quadratische mittlere Abweichung (RMSD) von 3,829 Å (849 Atome), was auf eine enge, aber nicht exakte Ausrichtung schließen lässt, die wahrscheinlich auf die relativ größere Größe von MenT3 zurückzuführen ist (Abb. 2C). Dennoch sind die Kernfalten- und Domänenstrukturen ähnlich (Abb. 2C). Die Überlagerung von MenT1 mit MenT4 ergab einen RMSD von 4,232 Å (889 Atome) und eine ähnliche Ausrichtung der Kernregionen (Abb. 2D). Wichtig ist, dass sich die identifizierten katalytischen Regionen gemeinsam lokalisieren, wenn alle drei gelösten Toxine ausgerichtet sind (Abb. 2E, F). Dies ermöglichte die Identifizierung wichtiger konservierter katalytischer Reste für MenT1, nämlich T39 (S78, S67 in MenT3 bzw. MenT4), D41 (D80, D69 in MenT3, MenT4), K137 (K189, K171 in MenT3, MenT4) und D152 ( D211, D186 in MenT3, MenT4). Die vier aus der Struktur identifizierten konservierten mutmaßlichen katalytischen Reste von MenT1 wurden durch Alanin ersetzt und in vivo auf ihre Toxizität getestet, wenn sie sowohl in M. tuberculosis ΔmenAT1 (Abb. 2G) als auch in M. smegmatis (Abb. S3E) exprimiert wurden. Während D41A-, K137A- und D152A-Substitutionen die MenT1-Toxizität in beiden Bakterien aufhoben, blieb T39A toxisch, was mit der Toxizität der entsprechenden S78A-Substitution in MenT3 übereinstimmt. Diese Daten zeigen eine starke Erhaltung der vorgeschlagenen katalytischen Stelle von MenT-ähnlichen Toxinen.

Eine Struktur des monomeren MenT1-Toxins, mit Ansichten von vorne und hinten, dargestellt als Cartoons in der Farbe „Sand“. N- und C-Termini sind angegeben. B Oberflächenelektrostatik von MenT1, dargestellt wie in (A), mit Rot für elektronegatives und Blau für elektropositives Potenzial. Elektrostatik wurde mit Standardeinstellungen für das APBS-Plugin (PyMol) generiert. Das Kästchen zeigt den wahrscheinlichen Ort der Katalyse an. C Überlagerung von MenT1 und MenT3 (Cyan-Cartoon), betrachtet gemäß (A). D Überlagerung von MenT1 und MenT4 (Lachs-Cartoon), betrachtet gemäß (A). E Überlagerung von MenT1, MenT3 und MenT4, betrachtet gemäß (A). F Nahaufnahme der umrahmten Region in (E), die Reste des aktiven Zentrums des MenT-Toxins hervorhebt. Ein GA-Toxizitätstest wurde durchgeführt, um das potenzielle Aktivitätszentrum von MenT1 bei M. tuberculosis zu bewerten. Der mutierte Stamm Δ(menA1-menT1)::ZeoR wurde mit 100 ng Plasmiden transformiert, die entweder MenT1 WT oder die mutierten Allele T39A, D41A, K137A oder D152A exprimierten. Nach der phänotypischen Expression wurde die Hälfte des Transformationsmixes auf 7H11-OADC-Platten mit Sm ausplattiert, und die andere Hälfte wurde auf 7H11-OADC-Sm-Platten ausplattiert, die mit 200 ng.ml−1 Atc ergänzt waren. Die Platten wurden 20 Tage lang bei 37 °C inkubiert. Die präsentierten Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente.

Bemerkenswerterweise weist die MenT1-Kristallstruktur zwei MenT1-Protomere in der asymmetrischen Einheit auf (Abb. S3A). Die Ausrichtung beider Protomeren führt zu einem niedrigen RMSD von 0,301 Å (1105 Atome), was zeigt, dass beide Protomere sehr ähnlich sind (Abb. S3B). Die MenT1-Kristallstruktur wurde an PDBsum36 übermittelt, um eine detaillierte Analyse der jeweiligen MenT1-Protomer-Protomer-Bindungsschnittstellen zu erstellen. Während PDBsum eine vergrabene Oberfläche von 1134 Å2 berechnete, bestanden die Grenzflächen hauptsächlich nur aus Van-der-Waals-Wechselwirkungen. Darüber hinaus war gereinigtes MenT1 laut Größenausschlusschromatographie (SEC) in Lösung monomer (Abb. S3C, D). Dies stimmt mit den bekannten Lösungszuständen von MenT3 und MenT425 überein und bestätigt, dass MenT1 ebenfalls Monomer ist, wobei das Vorhandensein von zwei Protomeren in der asymmetrischen Einheit ein Ergebnis der kristallographischen Packung ist.

Die strukturelle Überlagerung von MenT1 mit ANT2 (PDB 4XJE) zeigte einen möglichen Bindungsmodus für Nukleotidsubstrate, wobei das Triphosphat durch zweiwertige Metallionen koordiniert wird, die von den konservierten MenT1-Resten D41 und D43 unterstützt werden (Abb. S4A). Die strukturelle Überlagerung von MenT1 mit einem CCA-addierenden Enzym aus A. fulgidus (PDB 3OVA) zeigt nicht nur einen ähnlichen möglichen Nukleotidbindungsmodus (Abb. S4B), sondern auch die mögliche Positionierung eines tRNA-Substrats, das sich über die MenT1-Oberfläche wickelt und präsentiert das 3′-Ende am aktiven Zentrum (Abb. S4C).

Frühere Arbeiten zeigten, dass MenT3 die Proteinsynthese in vitro hemmt25. Wir haben MenT1 WT und die inaktive D41A-Mutante gereinigt, um ihren Einfluss auf die Proteinsynthese mithilfe des E. coli-Transkriptions-/Translations-gekoppelten PURE-Assays zu testen, wie zuvor beschrieben25,37. Mehrere Versuche mit unterschiedlichen Modellsubstraten zeigten zunächst keinen nachweisbaren Effekt von MenT1, was mit dem völligen Fehlen einer MenT1-Toxizität in E. coli korrespondiert25. Im Gegensatz zu E. coli, das über mehrere Kopien der meisten tRNA-Gene verfügt38, verfügen sowohl M. smegmatis als auch M. tuberculosis nur über einzelne Kopien der meisten tRNA-Gene, mit Ausnahme von tRNAMet (CAT) und tRNACys ​​(GCA)39, die sie herstellen könnten empfindlicher gegenüber tRNA-modifizierenden Toxinen. Da das PURE-System einen Überschuss an jeder E. coli-tRNA aufweist, gingen wir davon aus, dass eine Verringerung der tRNA-Konzentration Auswirkungen von MenT1 auf die Translation aufdecken könnte. Dementsprechend zeigte die Inkubation von MenT1 bei einer niedrigeren tRNA-Konzentration, dass MenT1 WT, jedoch nicht die katalytische Mutante D41A, die Synthese sowohl von GFP- als auch von WaaF-Modellproteinen hemmen konnte (Abb. 3A).

Eine Gesamt-tRNA aus E. coli wurde mit MenT1 in vitro vorinkubiert und anschließend in einem zellfreien Translationsassay verwendet. Die Proben wurden auf einem 4–20 %igen SDS-PAGE-Gel aufgetrennt und die Expressionsniveaus der GFP- und WaaF-Modellsubstrate mithilfe von Anti-GFP-Antikörpern bzw. Autoradiographie bestimmt. Die B-tRNA-Modifikation durch MenT1 wurde analysiert, indem 1 µg Gesamt-RNA aus M. smegmatis, M. tuberculosis oder E. coli oder 100 ng gereinigte E. coli-tRNA mit MenT1 (5 µM) in Gegenwart von [α−32P ] markierte NTPs bei 37 °C für 2 Stunden. Die Proben wurden auf einem 6 % Harnstoff-PAGE-Gel aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. C Gesamt-RNA von M. smegmatis wurde mit MenT1 (5 µM) in Gegenwart von [α−32P]-markiertem ATP, UTP, GTP oder CTP 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Repräsentative Ergebnisse von Dreifachexperimenten werden gezeigt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Durch MenT1 modifizierte D-tRNA-3′-Enden wurden durch Inkubation von Gesamt-RNA aus M. smegmatis mit oder ohne MenT1 in Gegenwart von CTP bei 37 ° C für 1 Stunde kartiert; Die endgültige RNA- und Proteinkonzentration betrug 0,5 µg.µl−1 bzw. 1 µg.µl−1. Anschließend wurden die Proben mit einer Demethylase behandelt und die Bibliothek wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben aufgebaut. Die DNA wurde anschließend sequenziert und die gesamten modifizierten tRNA-Reads wurden in Proben mit oder ohne MenT1 gezählt. E Modifikation jeder spezifischen tRNA-Form (D) wird gezeigt. Die Ergebnisse stammen aus zwei unabhängigen Experimenten.

Die Tatsache, dass MenT1 strukturell mit MenT3 verwandt ist und auch die Proteinsynthese beeinflusst, legt nahe, dass MenT1 auch als tRNA-NTase fungieren könnte. Bei Tests in Gegenwart von markierten [α-32P]-NTPs zeigte die In-vitro-Inkubation von MenT1 mit entweder Gesamt-RNA-Extrakten aus M. smegmatis, M. tuberculosis und E. coli oder gereinigter Gesamt-tRNA von E. coli dies In allen Fällen traten markierte Produkte in der Größe von tRNAs auf, was darauf hindeutet, dass MenT1 tatsächlich Nukleotide auf tRNA übertragen könnte (Abb. 3B). Die Inkubation von MenT1 und der gesamten M. smegmatis-RNA in Gegenwart jedes einzelnen markierten Nukleotids ergab, dass MenT1 in vitro eine starke Präferenz für CTP aufweist, obwohl auch bei den anderen drei getesteten Nukleotiden schwächere, aber nachweisbare Modifikationen beobachtet werden konnten. Bemerkenswerterweise war die D41A-Mutante nicht in der Lage, Nukleotide zu übertragen (Abb. 3C).

Die CTP-Abhängigkeit (Abb. 3C) und die mehreren Banden markierter tRNAs (Abb. 3B) ließen darauf schließen, dass MenT1 möglicherweise Cytidine zu verschiedenen tRNAs hinzufügt. Wir haben weitere Untersuchungen durchgeführt, indem wir eine Sequenzierungsmethode entwickelt und implementiert haben, die die genaue Kartierung der 3′-OH-Enden von tRNA ermöglicht (Abb. S5A). Gesamt-RNA-Extrakte von M. smegmatis (wie in Abb. 3B verwendet) wurden mit gereinigtem MenT1 in Gegenwart von CTP inkubiert und die 3′-OH-RNA-seq-Bibliotheken wurden generiert und sequenziert (Abb. 3D, E). Unsere Daten zeigen, dass in Abwesenheit des Toxins die überwiegende Mehrheit (über 99,4 %) der tRNA-Enden die erwartete CCA-Akzeptorsequenz besaßen, wohingegen in Gegenwart des Toxins ~30 % zusätzliche Cytidine erworben hatten, d. h. 24,3 % mit CCA + C, 4,9 % mit CCA + CC und 0,3 % mit CCA + CCC. Bei der Analyse des Modifikationsmusters der 31 identifizierten einzelnen tRNAs stellten wir fest, dass alle identifizierten tRNAs in ähnlichem Ausmaß modifiziert waren, was darauf hindeutet, dass MenT1 in vitro keine offensichtliche Präferenz für spezifische tRNAs aufweist (Abb. 3E). Beachten Sie, dass biologische Replikate und Gesamtablesungen aller tRNA-Seq-Experimente im ergänzenden Datenblatt 1 angegeben sind. Um weiter zu bestätigen, dass MenT1 den größten Teil der tRNA modifizieren kann, wurde jede der 45 tRNAs von M. tuberculosis einzeln in vitro unter Verwendung von T7-RNA transkribiert Polymerase untersucht und auf tRNA-Modifikation durch MenT1 in Gegenwart von [α-32P]-CTP untersucht. Ein solches nicht-quantitatives Screening, bei dem nur 3′-Modifikationen der tRNA nachgewiesen werden, bestätigte, dass fast die gesamte tRNA, in diesem Fall 42 von 45, in Gegenwart von MenT1 mit CMP markiert werden konnte (Abb. 4A). Da die nach der T7-Transkription erzeugten 3′-Enden sehr heterogen sind, wählten wir als nächstes unabhängig voneinander fünf repräsentative tRNAs aus M. tuberculosis aus, nämlich tRNA-Gly-3, -His, -Leu-3, -Met-2 und -Ser-4 markierte sie mit [α-32P]-CTP und reinigte sie mithilfe einer Spaltungsmethode, die homogene 3′-OH-Enden erzeugte (Abb. 4B, oberes Feld). Die in Abb. 4B dargestellten In-vitro-Daten zeigen, dass MenT1 alle fünf tRNAs in Gegenwart von CTP modifizieren konnte, obwohl einige Intensitätsunterschiede zwischen diesen tRNAs beobachtet werden konnten (Leu-3 und Ser-4 wurden weniger intensiv modifiziert), was darauf hindeutet Es könnte eine gewisse Präferenz bestehen. Diese Daten bestätigten außerdem, dass CTP das bevorzugte Substrat von MenT1 ist (Abb. 4C). Bemerkenswerterweise stellten wir in Gegenwart von CTP oder GTP und in geringerem Maße von UTP fest, dass das Vorhandensein der katalytischen mutierten MenT1-D41A-Substitution die Bildung einer kürzeren tRNA-Spezies induziert (Abb. 4C), die wir durch tRNA-Sequenzierung identifizieren konnten als Gly-3 sein letztes Adenosinnukleotid (CCΔA, was etwa 11% der Gly-3-CCA-Enden darstellt) abspaltete (Abb. S5B, ergänzendes Datenblatt 1), was auf eine 3'- bis 5'-Exonukleaseaktivität dieses ungiftigen MenT1 schließen lässt Derivat.

A Die 45 M. tuberculosis-tRNAs wurden in vitro T7-transkribiert und separat mit MenT1 in Gegenwart von [α-32P]-CTP bei 37 °C für 2 Stunden inkubiert. tRNAs wurden auf einem 6 % Harnstoff-PAGE-Gel aufgetrennt und durch Autoradiographie nachgewiesen. Dieses Screening-Verfahren aller 45 tRNA wurde einmal durchgeführt. B M. tuberculosis-tRNAs mit homogenen 3′-Enden wurden nach Ribozym-vermittelter Spaltung erzeugt (oberes Schema). Ausgewählte [α-32P]-CTP-markierte M. tuberculosis-tRNAs wurden separat mit MenT1 (5 µM) 4 Stunden lang bei 37 °C in Gegenwart von unmarkiertem CTP inkubiert. C [α-32P]-CTP-markierte M. tuberculosis-tRNA Gly-3 wurde mit 5 µM MenT1 WT oder MenT1 D41A 4 Stunden lang bei 37 °C in Gegenwart von unmarkiertem ATP, UTP, GTP oder CTP inkubiert. Die roten Pfeile zeigen das Vorhandensein einer Cytidin-Verlängerung an. D, E MenT1-3′-Endpräferenz wurde durch Inkubation von [α-32P]-CTP-markierter M. tuberculosis-tRNA-Gly-3, 3′-verkürzten Varianten oder 3′-Einzelmutationen mit MenT1 (5 µM) für 4 Stunden bei 37 °C bestimmt C in Gegenwart von unmarkiertem CTP. F Der Akzeptorstamm der Gly-3-tRNA-Modifikation durch MenT1 in vitro. Der synthetisierte Akzeptorstamm von Gly-3-tRNA oder 3′-Trimmvarianten wurden mit MenT1 (5 µM) 2 Stunden lang bei 37 °C in Gegenwart von [α-32P]-CTP inkubiert. Repräsentative Ergebnisse von Dreifachexperimenten werden gezeigt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Schließlich wurde Gly-3-tRNA verwendet, um die Bedeutung von 3′-Endnukleotiden für die Erkennung durch MenT1 zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass die Deletion des CCA mit oder ohne Diskriminierungsbasis (ΔCCA und ΔUCCA) oder die Deletion oder Mutation des letzten Adenosins die Gly-3-Modifikation durch MenT1 aufhob (Abb. 4D). Darüber hinaus zeigten Mutationen der CC-Positionen des CCA-Endes der Gly-3-tRNA (d. h. CAA-, CTA-, CGA-, ACA-, TCA- und GCA-Enden) nur geringe (CTA und GCA) oder keine nachweisbare Wirkung (CAA, CGA, ACA und TCA) auf die Modifikation durch MenT1 (Abb. 4E), was in scharfem Kontrast zum Hemmeffekt der Mutation im letzten Adenosin steht (Abb. 4D). Um zu untersuchen, ob der tRNA-Akzeptorstamm allein ausreicht, um von MenT1 erkannt und modifiziert zu werden, wurden ein Gly-3-tRNA-Akzeptorstammkonstrukt und mehrere seiner Varianten mit aufeinanderfolgenden Deletionen des UCCA-3′-Endes auf Modifikation durch MenT1 getestet das Vorhandensein von [α-32P]-CTP (Abb. 4F). In diesem Fall stellten wir fest, dass der Gly-3-tRNA-Akzeptorstamm, der das Wildtyp-CCA-Ende enthält, immer noch durch MenT1 modifiziert werden konnte. In Übereinstimmung mit den mit der Gly-3-tRNA voller Länge erhaltenen Daten reichte die Deletion des letzten Adenosins aus, um die Modifikation durch MenT1 zu hemmen (Abb. 4F).

Im Gegensatz zu MenA3 und MenA4, die zur COG5340-Antitoxinfamilie27,41,42 gehören, ist MenA1 ein deutlich kürzeres Protein (68 Aminosäuren), von dem ursprünglich vorhergesagt wurde, dass es zu den Typ-I-SymE-RNase-Toxinen gehört12. Wir haben MenA1 gereinigt und getestet, ob es die MenT1-Aktivität in vitro hemmen kann, wobei wir sowohl Gesamt-RNA-Extrakte als auch Gly-3-tRNA als Substrate verwendeten (Abb. 5A, B). Unsere Ergebnisse zeigen, dass die gleichzeitige Inkubation von MenA1 mit MenT1 den CMP-Transfer auf tRNA verhindert, was darauf hindeutet, dass MenA1 tatsächlich die MenT1-NTase-Aktivität in vitro hemmen kann.

1 µg Gesamt-RNA von M. smegmatis wurde mit MenT1 (5 µM) zusammen mit [α-32P]-markiertem CTP 2 Stunden lang bei 37 °C in Gegenwart steigender Molverhältnisse des MenA1-Antitoxins inkubiert. Repräsentative Ergebnisse von Dreifachexperimenten werden gezeigt. B [α-32P]-CTP-markierte M. tuberculosis-tRNA Gly-3 wurde mit 5 µM MenT1 WT oder MenT1 D41A 4 Stunden lang bei 37 °C in Gegenwart von unmarkiertem CTP und steigenden Molverhältnissen von MenA1-Antitoxin inkubiert. Repräsentative Ergebnisse von Dreifachexperimenten werden gezeigt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. C Gereinigte MenT1- und MenA1-Proben wurden kombiniert und über Nacht inkubiert und dann durch Größenausschlusschromatographie (SEC) unter Verwendung einer HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 SEC-Säule (Cytiva) getrennt. MenAT1 eluierte bei einem Elutionsvolumen von 52,7 ml, was einer Masse entspricht, die dem vorhergesagten Mr eines heterotrimeren MenT1:MenA1:MenT1-Komplexes entspricht. MenT1 eluierte bei 63,4 ml, was einer massenangepassten Monomermenge von MenT1 entspricht. D, E Struktur des MenAT1-Komplexes mit Ansichten von jeder Seite, oben und unten, dargestellt als Cartoons in den Farben Orange (MenT1α), Blau (MenA1) und Hellorange (MenT1β). N- und C-Termini sind angegeben. Um den Vergleich ihrer relativen Positionen mit MenA1 zu erleichtern, sind die Positionen der in Abb. 2F identifizierten Reste des aktiven Zentrums (T39, D41, K137 und D152) angegeben. Die Reste sind als Stäbchen dargestellt, rot für Sauerstoff und blau für Stickstoff. Die in (E) gezeichneten schwarzen Kästchen entsprechen den Regionen, die im Detail als Tafeln in Abb. 6A–D dargestellt sind.

MenA3 ist eine antitoxische Kinase, von der angenommen wird, dass sie MenT3 hemmt, indem sie den Rest S78 in der katalytischen Stelle von MenT3 phosphoryliert. In diesem Fall hob die Alaninsubstitution S78A die MenT3-Hemmung durch MenA327 vollständig auf. MenA1 verfügt jedoch über keine durch Sequenz nachweisbare Kinasedomäne, und die entsprechende T39A-Substitution in MenT1 wurde immer noch durch MenA1 gehemmt (Abb. S6A), was auf eine andere Art der Antitoxizität schließen lässt. Die SEC-Analyse ergab, dass die gemeinsame Inkubation von gereinigtem MenA1 und MenT1 zur Bildung eines Komplexes mit höherem Molekulargewicht von etwa 50,4 kDa führte (Abb. 5C), was auf die Existenz eines stabilen TA-Komplexes schließen lässt, in dem das MenT1-Toxin durch sein verwandtes Toxin neutralisiert wird Antitoxin. Daher haben wir MenT1 und MenA1 über Nacht gemeinsam inkubiert, den Komplex erneut gereinigt und die Probe in Kristallisationsversuchen verwendet. Anschließend bestimmten wir die röntgenkristallographische Struktur des MenAT1-Komplexes mit einer Auflösung von 1,44 Å (Abb. 5D, E, Tabelle 1). Die MenAT1-Kristallstruktur besteht aus zwei MenT1-Protomeren (MenT1α und MenT1β), die an ein MenA1-Antitoxinmonomer gebunden sind und einen MenT1α:MenA1:MenT1β-Komplex bilden (Abb. 5D, E). In den Ketten von MenT1α und MenT1β sind eine bzw. zwei Lücken vorhanden, die in externen flexiblen Schleifen auftreten. Das Antitoxinprotein MenA1 besteht aus einer langen zentralen Helix (α1), die über eine flexible Schleife mit einer kürzeren C-terminalen Helix (α2) verbunden ist. Die α2-Helix faltet sich teilweise in Richtung der α1-Helix zurück, ist jedoch nach außen abgewinkelt und bildet eine asymmetrische, verdrehte „V“-Form (Abb. 5D, E). Nur 51 von 68 Aminosäuren wurden in der MenA1-Kristallstruktur aufgelöst. Die 17 Reste, für die es keine Elektronendichte gab, bilden den Rest des MenA1-C-Terminus, der zur Außenseite der Kristallstruktur hin ausgerichtet ist (Abb. 5D, E). Basierend auf dieser Struktur haben wir zwei verkürzte Versionen von MenA1 entwickelt, von denen eine die 51 in der Struktur aufgelösten Aminosäuren enthält und die andere nur die 32 Aminosäuren der großen zentralen Helix (α1). Beide verkürzten Versionen von MenA1 zeigten bei Expression in M. smegmatis eine ähnliche antitoxische Aktivität wie MenA1 in voller Länge (Abb. 6, Abb. S6). Dies legt nahe, dass die C-terminale Helix und die ungelösten Reste von MenA1 bei Überexpression nicht für die Toxinhemmung erforderlich sind.

A–C Nahaufnahmen der eingerahmten Regionen aus (Abb. 5E), gedreht, um MenA1 horizontal zu platzieren, gefärbt gemäß (Abb. 5E). D Nahaufnahme des umrahmten Bereichs aus (Abb. 5E), gefärbt gemäß (Abb. 5E). Schwarze Zahlen geben gemessene Bindungslängen in Å an. E Toxizitäts- und Antitoxizitätstests wurden in M. smegmatis durchgeführt, um die Wirkung von MenA1 auf MenT1 zu untersuchen. Cotransformanten von M. smegmatis, enthaltend (i) pGMC-Vektor (-), MenT1 WT oder MenT1 F28A-, F38A- oder F28A/F38A-Mutanten und pLAM-Vektor (-) oder MenA1 WT (linkes Feld) oder (ii ) MenT1 WT und MenA1 WT oder MenA1 L12R, L14R, V19R, L12R/V19R, L14R/V19R, 1–32 oder 1–52 Mutanten (rechtes Feld) wurden seriell verdünnt und in Gegenwart von oder auf LB-Agarplatten getupft Fehlen von Induktoren (Atc, 100 ng.ml−1 oder Ace, 0,2 %). Die Platten wurden 3 Tage lang bei 37 °C inkubiert. Repräsentative Ergebnisse von Dreifachexperimenten werden gezeigt.

Die SEC-Spur der kombinierten gereinigten MenT1- und MenA1-Proben bestätigt die Bildung eines heterotrimeren Komplexes in Lösung (Abb. 5C), und die Größe von MenA1 wurde durch SDS-PAGE-Analyse bestätigt (Abb. S7A). Innerhalb der komplexen Struktur bindet das gelöste MenA1-Antitoxin asymmetrisch und verläuft in entgegengesetzte Richtungen über dieselbe Seite jedes MenT1-Protomers (Abb. S7B, C). Dies bringt die elektropositiven Hohlräume jedes MenT1-Protomers nebeneinander, was darauf hindeutet, dass MenA1 die MenT1-Toxizität verhindert, indem es das aktive Zentrum blockiert. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass sich die MenAT1-Interaktionen von denen von MenAT3 und MenAT4 unterscheiden.

Die MenA1:MenT1-Bindungsschnittstellen wurden untersucht, um Schlüsselreste für die Proteinkomplexbildung zu identifizieren. Nahaufnahmen zeigten drei hydrophobe MenT1-Taschen, mit denen MenA1 interagiert (Abb. 6A – C). Aufgrund der asymmetrischen Bindung von MenA1 liegen zwei identische hydrophobe MenT1-Taschen MenA1 gegenüber, eine von jedem MenT1-Protomer, und binden gegenüberliegende Seiten der MenA1-Helix α1 (Abb. 6A, B). Die MenA1-Reste L14 und V19 binden in Taschen, die mit L8, L120 und L123 von MenT1α bzw. MenT1β ausgekleidet sind (Abb. 6A, B). Unterdessen interagiert der Rest L12 von MenA1 mit den Resten A3 und V4 der N-terminalen α-Helix von MenT1β, die mit MenT1β A93 und V95 eine hydrophobe Region aus einer Linkerschleife bilden, die die β-Stränge verbindet (Abb. 6C). Im Verhältnis zu diesen drei Taschen, die an den Seiten der MenA1-Helix α1 ausgerichtet sind, gibt es unter der MenA1-Helix α1 eine MenT1α:MenT1β-Wechselwirkung, die durch Schleifen gebildet wird, die F38 enthalten, und die Positionen dieser Schleifen unterscheiden sich in jedem Protomer (Abb. 6D). ). Eine Nahaufnahme der Interaktionsschnittstelle zeigt, dass MenT1α F38 durch die Asymmetrie der MenA1-Bindung herausgezogen wird, was die Bildung eines hydrophoben Netzwerks ermöglicht, das MenT1α F38, MenT1β F28 und MenT1β F38 umfasst, die unter MenA1 gestapelt sind (Abb. 6D). Dieses Interaktionsnetzwerk weist auf die wahrscheinliche Bedeutung dieser Schleifen und der MenT1-Reste F28 und F38 für die MenA1-Bindung und die anschließende Bildung des MenAT1-Komplexes hin. Um eine solche Hypothese zu verifizieren, konstruierten wir zunächst eine Reihe von Alaninsubstitutionen an diesen Resten, d (Abb. 6E). In diesem Fall stellten wir fest, dass MenA1 MenT1 F28A/F38A und in geringerem Maße MenT1 F38A im Vergleich zu MenT1 WT nur schwach hemmt, was darauf hindeutet, dass diese Region tatsächlich für die Toxinneutralisierung wichtig ist. Beachten Sie, dass die einzelne F28A-Substitution auch die MenT1-Toxizität geringfügig beeinflusste (Abb. 6E). Darüber hinaus haben wir mehrere Substitutionen in der interagierenden Oberfläche von MenA1 konstruiert und sie in M. smegmatis getestet (Abb. 6E). Während die einzelnen L12R-, L14R- oder V19R-Substitutionen von MenA1 keinen Einfluss hatten, zeigten die doppelten L12R/V19R- oder L14R/V19R-Substitutionen einen starken Effekt auf die MenA1-Aktivität (Abb. 6E), was darauf hinweist, dass diese Regionen tatsächlich für die MenT1-Hemmung wichtig sind.

Die MenAT1-Kristallstruktur wurde zur Analyse an PDBsum36 übermittelt. PDBsum berechnete eine vergrabene Oberfläche von 895 Å2 zwischen MenA1 und MenT1β und identifizierte eine Salzbrücke zwischen MenA1 R27 und MenT1β E35, unterstützt durch Wasserstoffbrückenbindungen mit MenA1 W47 (Abb. 6D). Der Rest der berechneten MenA1:MenT1β-Schnittstelle wurde durch Van-der-Waals-Wechselwirkungen gebildet. Für MenA1:MenT1α berechnete PDBsum eine vergrabene Oberfläche von 1189 Å2. Es wurde erneut angenommen, dass der Großteil der Grenzfläche durch Van-der-Waals-Wechselwirkungen entsteht, wobei Wasserstoffbrücken auch durch mehrere Wechselwirkungen entstehen, darunter wiederum MenA1 W47 und MenT1α R40 (Abb. 6D). Beachten Sie, dass sich beim Einfügen von MenA1 W47 zwischen MenT1α R40 und MenT1β E35 eine direkte Salzbrücke zwischen MenT1β R40 und MenT1α E35 an der reziproken Stelle auf der anderen Seite des Komplexes bildet (Abb. 6D). Dieser Bereich unterschiedlicher Salzbrücken und Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen zwischen MenA1:MenT1α und MenA1:MenT1β unterstreicht die asymmetrische Bindung von MenA1 an die MenT1-Protomere. Insgesamt unterstützen die Daten die Bildung eines heterotrimeren MenT1α:MenA1:MenT1β-Komplexes.

Die Ausrichtung der Strukturen von MenT1α und MenT1β anhand der MenAT1-Struktur ergibt einen RMSD von 0,494 Å (1988 Atome), was auf eine nahezu identische Strukturarchitektur hinweist. Die einzigen großen Unterschiede sind die unterschiedlichen Positionen der F38-Schleife und Variationen in der Position der C-terminalen α-Helix (Abb. S8A). Die Ausrichtung der beiden MenT1-Protomere aus der MenT1-Apo-Struktur mit beiden MenT1-Protomeren aus der MenAT1-Komplexstruktur zeigt ähnlich geringe Variationen (Abb. S8B). Wenn die MenT1-Struktur der MenAT1-Struktur überlagert wird und sich über MenT1α ausrichtet, ist klar, dass die zweiten MenT1-Protomere in sehr unterschiedlichen relativen Positionen gefunden werden (Abb. S8C). Innerhalb dieser Ausrichtung kommt es zu einer Kollision zwischen MenA1 und dem zweiten Protomer der MenT1-Apo-Struktur (Abb. S8C). Dies weist weiter darauf hin, dass die beiden Protomere innerhalb der MenT1-Apo-Struktur nicht so angeordnet sind, dass sie für die Interaktion mit MenA1 geeignet sind, und daher, wie durch SEC-Daten gestützt (Abb. S3C), das Vorhandensein von zwei Protomeren im MenT1-Apo Kristalle sind lediglich ein Ergebnis der Kristallpackung. Zusammengenommen heben diese Strukturen konservierte Strukturmotive innerhalb der MenAT-Familie hervor, inmitten auffälliger Unterschiede in der Art und Weise, wie die Toxine und Antitoxine interagieren.

Nachdem wir die In-vitro-tRNA-NTase-Aktivität von MenT1 charakterisiert hatten (Abb. 3), führten wir anschließend eine ähnliche Analyse mit dem bislang biochemisch nicht charakterisierten Toxin MenT4 durch. Bei Tests in Gegenwart markierter [α-32P]-NTPs zeigte die In-vitro-Inkubation von MenT4 mit Gesamt-RNA-Extrakten von M. smegmatis erfolgreich das Auftreten markierter Produkte in der Größe von tRNAs (Abb. 7A). Unerwarteterweise verwendete die tRNA-NTase-Aktivität von MenT4 GTP (Abb. 7A) und nicht CTP, wie bei MenT1 (Abb. 3).

1 µg Gesamt-RNA von M. smegmatis wurde mit MenT4 (5 µM) in Gegenwart von [α−32P]-markiertem ATP, UTP, GTP oder CTP 3 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Gesamt-RNA wurde auf einem 6 % Harnstoff-PAGE-Gel aufgetrennt und durch Autoradiographie nachgewiesen. Es werden repräsentative Ergebnisse doppelter Experimente angezeigt. B Um die Aktivität von MenT4 auf tRNA-Substraten zu untersuchen, wurde eine tRNA-3′-Kartierung unter Verwendung von 5 µg Gesamt-RNA von M. smegmatis durchgeführt, die mit 10 µg MenT4 in Gegenwart von GTP bei 37 °C für 2 Stunden inkubiert wurde. Anschließend wurde eine tRNA-Sequenzierungsbibliothek erstellt und sequenziert. Der Prozentsatz der Modifikation für die gesamte tRNA (links) und für jede identifizierte tRNA (rechts) wird angezeigt. Es werden repräsentative Ergebnisse doppelter Experimente angezeigt.

Als nächstes untersuchten wir mithilfe der tRNA-Sequenzierung (Abb. S5), welche tRNAs durch MenT4 verändert wurden. Gesamt-RNA-Extrakte von M. smegmatis (wie in Abb. 3B verwendet) wurden mit gereinigtem MenT4 in Gegenwart von GTP inkubiert und die 3′-OH-RNA-seq-Bibliotheken wurden generiert und sequenziert (Abb. 7B). In Abwesenheit des Toxins besaß wiederum die Mehrheit (über 99,8 %) der tRNA-Enden die erwartete CCA-Akzeptorsequenz, während in Gegenwart des Toxins MenT4 etwa 2 % zusätzliche Guanosine (ein oder zwei) erworben hatten. Obwohl dies eine deutliche In-vitro-Aktivität für MenT4 zeigt, scheint sie geringer zu sein als für MenT1 (Abb. 3D). Schließlich wurde gezeigt, dass MenT4 34 der 37 im Sequenzierungsexperiment identifizierten tRNA modifiziert (Abb. 7B, ergänzendes Datenblatt 1), was darauf hindeutet, dass MenT4 auch keine starke Präferenz für spezifische tRNA aufweist. Insgesamt zeigen diese Daten, dass MenT-Toxine Nukleotidpräferenzen haben, in der Anzahl der Basen, die den Ziel-tRNAs in vitro hinzugefügt werden, variieren können und dass tRNA-NTase-Aktivität in der gesamten MenT-Familie beobachtet werden kann.

Diese Arbeit hat das TA-Paar MenAT1 (SymE-like/NTase) des wichtigsten menschlichen Krankheitserregers M. tuberculosis charakterisiert und den Toxizitätsmechanismus von MenT1 und seine Wechselwirkung mit dem MenA1-Antitoxin aufgeklärt. Wir zeigen, dass MenT1 eine echte NTase ist, die die Aminoacylierung von tRNAs verhindert, indem sie spezifisch Cytidine an ihre 3′-CCA-Enden anfügt, was zu einer Wachstumshemmung von M. tuberculosis führt. Darüber hinaus haben wir die Kristallstrukturen sowohl des Toxins allein als auch im Komplex mit seinem Antitoxin gelöst und so eine neuartige Wechselwirkung für MenAT-TA-Systeme aufgedeckt. Schließlich zeigen wir, dass die tRNA-Modifikation ein Kennzeichen von MenT-Toxinen ist.

MenT1 ist toxisch, wenn es in M. smegmatis oder M. tuberculosis exprimiert wird, hat jedoch keine nachweisbare Wirkung auf das E. coli-Wachstum, selbst wenn es in hohen Mengen überexprimiert wird25, und hemmt die Translation in zellfreien E. coli-Tests nicht, sofern es nicht vorinkubiert wird deutlich niedrigere Konzentrationen der gesamten tRNAs (Abb. 3A). Obwohl der Grund dafür, dass sich die MenT1-Toxizität nur in vivo bei Mykobakterien manifestiert, unbekannt ist, könnten Unterschiede in der Häufigkeit einiger, wenn nicht aller tRNAs von entscheidender Bedeutung sein. Während es keine vergleichende Studie über die tRNA-Häufigkeit in diesen Bakterien gibt, besitzt das E. coli-Genom mehrere tRNA-Gene, insgesamt 88, und das M. tuberculosis-Genom kodiert nur 45, was den beobachteten Unterschied in der Aktivität erklären könnte38,43. Darüber hinaus könnten auch Unterschiede in der tRNA-Modifikation, Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, Reparaturmechanismen (z. B. RNase PH) und Reifung (z. B. CCA-addierendes Enzym) oder das Fehlen spezifischer Partner in E. coli eine Rolle spielen. Es ist beispielsweise nicht bekannt, ob native tRNA-Modifikationen, die während ihrer Reifung auftreten, ihre Erkennung und Modifikation durch MenT1 beeinflussen könnten. Die Tatsache, dass unsere Modell-Gly-3-tRNA bei der Reinigung aus In-vivo-Zellextrakten (~40 %) durch MenT1 stärker verändert wurde als bei der In-vitro-Synthese (~13 %), legt nahe, dass reife tRNA von MenT1 effizienter angegriffen werden könnte.

Im Gegensatz zu MenT1 ist das MenT3-Toxin von M. tuberculosis in E. coli toxisch und hemmt die Translation in zellfreien E. coli-Assays effizient, ohne dass eine Vorinkubation oder Verdünnung des tRNA-Pools erforderlich ist25. Während MenT1 in vitro auf die meisten, wenn nicht alle tRNAs abzielen kann, zeigte MenT3 bemerkenswerterweise eine signifikante Präferenz für Serin-tRNA-Isoakzeptoren25, was darauf hindeutet, dass die gezielte Ausrichtung auf bestimmte tRNA-Sätze in vivo wirksamer sein könnte als die zufällige Ausrichtung auf alle tRNA. Dies steht im Einklang mit der Tatsache, dass MenT3 sowohl bei M. smegmatis als auch bei M. tuberculosis auch toxischer als MenT1 ist, d. h. (i) die Deletion von menT3 konnte nur in Gegenwart einer trans-Kopie von menA3 erreicht werden und (ii) seine Klonierung war nur möglich, wenn eine schwächere Shine-Dalgarno-Sequenz verwendet wurde25. Interessanterweise wurde kürzlich gezeigt, dass Serin-tRNAs im In-vivo-Steady-State die weniger häufig geladenen tRNAs von M. tuberculosis sind, was sie für MenT3 noch zugänglicher machen und somit dessen schädliche Wirkung noch verstärken würde44. Ob bestimmte Sequenzen oder Strukturelemente der Serin-tRNA zu einer solchen Präferenz von MenT3 beitragen würden, bleibt unbekannt. Obwohl Strukturvergleiche einen möglichen tRNA-Bindungsmodus für MenT-Toxine identifizierten (Abb. S4), liefert dies keine detaillierte strukturelle Begründung dafür, warum MenT3, aber nicht MenT1 oder MenT4, in vitro eine solche Präferenz zeigt. Schließlich zeigte die MenT4-Aktivität auch keine offensichtliche Präferenz für spezifische tRNA und eine weniger starke Toxizität als MenT325, was ein Kontinuum der Zielauswahl in der gesamten MenT-Toxinfamilie verdeutlicht. Eine attraktive Möglichkeit besteht darin, dass Toxine mit geringer Spezifität gegenüber der Wirts-tRNA, d. h. MenT1 und MenT4, gezielt auf die Aminoacylierung von phagenkodierter tRNA abzielen und diese verhindern würden8,45 und so als Phagenabwehrsysteme fungieren.

Bei anderen Toxinfamilien wurde das Targeting spezifischer tRNAs beobachtet. Während gezeigt wurde, dass Acetyltransferase-Toxine bevorzugt die primäre Amingruppe von geladenem (i) tRNAGly im Fall von TacT46,47,48 und (ii) tRNAIle, tRNAVal und tRNAMet für ItaT49,50 acetylieren, wurde gezeigt, dass das HEPN-Toxin letztere spaltet vier Nukleotide des 3′-Endes von nur einer Untergruppe von tRNAs51. Die ToxSAS-Toxine PhRel, CapRel und FaRel2 übertragen eine Pyrophosphateinheit von ATP auf das tRNA-CCA-Ende52, das CreT-RNA-Toxin bindet tRNAArg53 und die kanonische Serin-Threonin-Kinase HipA phosphoryliert die Glutamyl-tRNA-Synthetase, wodurch die Glutamyl-tRNA-Aufladung gehemmt wird54. Bei M. tuberculosis wurden bisher nur TacT (Rv0919), das auf Glycyl-tRNAs abzielt, und VapC4, das eine einzelne Stelle innerhalb der Anticodon-Sequenz von tRNACys ​​16 spaltet, identifiziert. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die gezielte Ausrichtung auf bestimmte tRNA-Sätze in vielen Fällen ein Markenzeichen für TA-Systeme sein könnte.

Unsere Arbeit zeigt, dass die Integrität eines tRNA-CCA-3′-Endes für die MenT1-Aktivität in vitro entscheidend ist, was darauf hindeutet, dass MenT1 wahrscheinlich in vivo auf reife, ungeladene tRNAs abzielen könnte, entweder aus neu synthetisierter tRNA oder aus Deacyl-tRNA, die während der Verlängerung freigesetzt wird. Wie M. tuberculosis auf einen derart reduzierten Pool an translationkompetenter tRNA reagieren würde, ist nicht bekannt. Interessanterweise wurde zuvor gezeigt, dass im Fall der GCN5-verwandten N-Acetyltransferase (GNAT)-Toxine von Salmonella48 und M. tuberculosis47 die schädliche Aminosäureacetylierung von Glycyl-tRNAs, die zur Translationshemmung führt, durch das Peptidyl- tRNA-Hydrolase Pth, die effizient die acetylierte Aminosäure von tRNA abspaltet und so die Proteinsynthese freigibt. Die Reifung der tRNA-CCA-3′-Enden erfolgt über exo- und/oder endonukleolytische Wege, an denen mehrere Ribonukleasen beteiligt sind, darunter RNase Z, RNase PH und/oder RNase T55,56 sowie CCA-addierende Enzyme56,57. Obwohl wir keine Beweise dafür haben, dass Cytidin-modifizierte tRNA über diese Wege bei M. tuberculosis erkannt und repariert werden kann, ist es vernünftig anzunehmen, dass der Erfolg von NTase-Toxinen zumindest teilweise von der Reparaturkapazität des Wirts abhängen könnte. Zwei Drittel (30/45) der tRNA-Gene von M. tuberculosis enthalten kein CCA-Motiv in ihren Sequenzen (während alle E. coli-tRNA-Gene über CCA verfügen) und müssen durch CCA-addierende Enzyme verarbeitet werden. Dies deutet darauf hin, dass in Gegenwart von aktiviertem MenT1 Reifungsenzyme, insbesondere CCA-addierende Enzyme, durch den neuen Pool an akkumulierenden deacylierten CCA + C(n)-tRNA-3′-Enden überwältigt werden könnten. Weitere Arbeiten sind erforderlich, um mögliche Rettungsmechanismen aufzuklären.

Innerhalb des MenAT1-Komplexes sind identische Stellen auf jedem der beiden MenT1-Protomere durch unabhängige Stellen auf dem einzelnen MenA1-Protomer gebunden, was auf die asymmetrische Bindung über die Flächen jedes Toxins zurückzuführen ist. Es gibt Präzedenzfälle für heterotrimere Toxin-Antitoxin-Komplexe. Beispiele hierfür sind die Kid-Toxinfamilie58, darunter PemIK59 und MazEF60. Bei PemIK aus Staphylococcus aureus wird ein PemK-Toxin-Dimer durch einen losen Strang (jedoch nicht durch eine strukturierte α-Helix) eines einzelnen PemI-Antitoxins blockiert. Obwohl die heterohexamere Struktur von MazEF60 aus Bacillus subtilis eine symmetrische TA-Komplexarchitektur zeigt, zeigt die individuelle Bindung eines MazE-Antitoxins an ein Dimer von MazF-Toxinen ein Heterotrimer, das durch eine Antitoxin-α-Helix blockiert ist. Obwohl sie dem MenAT1-Komplex weitgehend ähneln, gibt es in diesen Beispielen erhebliche Unterschiede, wie etwa, dass die beiden MenT1-Toxine selbst nicht als Dimer interagieren, sondern stattdessen als Monomere in Lösung vorliegen, die durch MenA1 im Komplex zusammengebracht werden. Im Gegensatz dazu existieren die PemK- und MazF-Toxine und wirken als dimere RNasen. Darüber hinaus haben die Familienfalten MenT und Kid nichts miteinander zu tun. Daher scheint MenAT1 einen neuartigen Komplex zu bilden, von dem angenommen wird, dass er MenT1-Toxine durch asymmetrische Antitoxinbindung sowohl bindet als auch blockiert. Diese Aktivität von MenA1 zeigt auch, dass innerhalb dieser einzigen Familie von MenAT-TA-Systemen mehrere Wege zur Hemmung gefunden werden können.

Diese Studie hat Heterogenität in mehreren Aspekten der Aktivitäten der MenAT-Familie gezeigt, wie z. B. Ziel-tRNA-Präferenzen, Verwendung von Nukleotiden als Substrate und Arten der Antitoxin-Hemmung. Wie diese die In-vivo-Rollen jedes MenAT-Systems widerspiegeln und welche Auswirkungen menAT-Deletionsmutanten bei M. tuberculosis haben, muss noch entdeckt werden.

Die Analyse der Gennachbarschaften für rv0078B (menA1) wurde unter Verwendung der Standardeinstellungen in FlaGs (http://www.webflags.se/) durchgeführt. Ausgabesequenzen für MenA1 und verwandte MenT1-Homologe wurden dann verwendet, um Sequenzausrichtungen mit MUSCLE (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/) durchzuführen und dann in Jalview (https://www.jalview) zu formatieren .org/), Sortierung nach paarweiser Ausrichtung. Interessante Reste wurden dann mit ESPript (https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/) hervorgehoben.

Es wurden die E. coli-Stämme BL21(λDE3) und BL21 (λDE3) AI (Novagen), DH5α (Invitrogen), BL21 (λDE3) ∆slyD25 und DLT190061 sowie M. smegmatis mc2155 (ATCC 700084) beschrieben. E. coli wurden routinemäßig bei 37 °C in LB-, M9- oder 2xYT-Medium gezüchtet, das bei Bedarf mit Kanamycin (Km, 50 μg.ml-1), Chloramphenicol (Cm, 34 μg.ml-1) und Ampicillin (Ap , 50 μg.ml-1), Spectinomycin (Sp, 50 μg.ml-1), Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG, 1 mM), L-Arabinose (L-ara, 0,1 % w/v) oder D-Glukose (Glu, 0,2 % w/v). M. smegmatis mc2155-Stämme wurden routinemäßig bei 37 °C entweder in LB- oder 7H9-Medium (Difco) gezüchtet, das bei Bedarf mit Km (10 μg.ml-1) oder Streptomycin (Sm, 25 μg.ml-1) ergänzt wurde. M. tuberculosis-Wildtyp-Stamm H37Rv (ATCC 27294) und mutierte Stämme wurden routinemäßig bei 37 °C in 7H9-Medium (Middlebrook 7H9-Medium, Difco) gezüchtet, ergänzt mit 10 % Albumin-Dextrose-Katalase (ADC, Difco) und 0,05 % Tween 80 (Sigma-Aldrich) oder auf vollständigem 7H11-Festmedium (Middlebrook 7H11-Agar, Difco), ergänzt mit 10 % Ölsäure-Albumin-Dextrose-Katalase (OADC, Difco). Bei Bedarf wurden Mykobakterien-Wachstumsmedien mit Hygromycin (Hy, 50 μg.ml-1), Sm (25 μg.ml-1), Zeocin (Zeo, 25 μg.ml-1) und Acetamid (Ace, 0,2 %) ergänzt. w/v) oder Anhydrotetracyclin (Atc, 100 oder 200 ng.ml−1).

Mutierte Stämme von M. tuberculosis H37Rv wurden durch Allelaustausch unter Verwendung von Rekombination62 wie beschrieben63 konstruiert. Zwei DNA-Fragmente (~0,5 kb), die die Gene von Interesse flankieren, wurden durch PCR mit PrimeSTAR GXL-DNA-Polymerase (Takara bio), genomischer M. tuberculosis H37Rv-DNA als Matrize und geeigneten Primerpaaren amplifiziert (Ergänzungstabelle S1). Eine Drei-Fragment-PCR fusionierte diese beiden Fragmente mit einer Zeo-Resistenzkassette und das resultierende Allelaustauschsubstrat (AES) wurde durch Agarosegelreinigungen gewonnen und zur Transformation von H37Rv verwendet, das das Plasmid pJV53H trägt, ein Hygromycin-resistentes, von pJV53 abgeleitetes Plasmid, das rekombinierende Enzyme exprimiert62. H37Rv/pJV53H wurde in vollständigem 7H9-Medium, ergänzt mit Hy, bis zur mittleren logarithmischen Phase gezüchtet, über Nacht bei 37 °C mit 0,2 % Ace (Sigma-Aldrich) behandelt und mit 100 ng des linearen AES elektrotransformiert. Nach 48-stündiger Inkubation bei 37 °C in vollständigem 7H9 ohne Antibiotikum wurde der Transformationsmix auf mit Zeo ergänzten Agarplatten ausplattiert und 21 Tage bei 37 °C inkubiert. Zeo-resistente Klone wurden auf demselben Medium ausgestrichen, und einzelne Kolonien wurden in vollständigem 7H9 ohne Antibiotika gezüchtet und durch PCR auf chromosomaler DNA unter Verwendung externer Primer verifiziert, dass sie den erwarteten Allelaustausch tragen. Der spontane Verlust des pJV53H-Plasmids wurde durch serielle Kulturrunden ohne Antibiotika und phänotypische Tests auf Resistenz gegen Zeo und Empfindlichkeit gegenüber Hy erzielt.

Die Plasmide pMPMK664, p29SEN65, pGMCS66, pLAM1262, pETDuet-1 und pET15b (Novagen) wurden beschrieben. Alle zur Konstruktion der Plasmide verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle S1 beschrieben. Das Plasmid pK6-MenT1 wurde wie folgt konstruiert. Rv0078A wurde aus dem M. tuberculosis H37Rv-Genom unter Verwendung der Primer Rv0078A EcoRI-For und Rv0078A HindIII-Rev PCR-amplifiziert und als EcoRI/HindIII-Fragmente in EcoRI/HindIII-verdautes pMPMK6 kloniert. Für p29-MenA1 wurde rv0078B mittels PCR aus dem H37Rv-Genom von M. tuberculosis unter Verwendung der Primer Rv0078B EcoRI-For und Rv0078B HindIII-Rev amplifiziert und als EcoRI/HindIII-Fragmente in EcoRI/HindIII-verdautes p29SEN kloniert.

Die Plasmide pGMC-MenT1 und pGMC-MenT1His wurden nach PCR-Amplifikation von rv0078A mit den Primern Rv0078A In-Fusion-For und Rv0078A In-Fusion-Rev und rv0078AHis mit den Primern Rv0078AHis In-Fusion-For und Rv0078A In-Fusion-Rev unter Verwendung von pK6 erhalten -MenT1 als Matrize und durch homologe Rekombination in linearisiertes pGMCS-Plasmid unter Verwendung von In-Fusion HD Cloning Kits (Takara Bio) kloniert. Das Plasmid pGMC-MenA1T1, das das Operon rv0078B-rv0078A enthält, wurde ebenfalls durch In-Fusion unter Verwendung der Primer Rv0078B In-Fusion-For und Rv0078A In-Fusion-Rev und des M. tuberculosis H37Rv-Genoms als Matrize erhalten. Die Plasmide pGMC-MenT1 mit T39A-, D41A-, K137A-, D152A-, F28A-, F38A- oder F28A/F38A-Substitutionen wurden durch ortsspezifische QuikChange-Mutagenese unter Verwendung geeigneter Primer und pGMC-MenT1 als Matrize konstruiert.

Das Plasmid p29-MenA1 wurde als Matrize zur Konstruktion von pLAM-MenA1 und pLAM-MenA1His verwendet. In diesem Fall wurden mit NdeI/EcoRI verdaute Fragmente von rv0078B und rv0078BHis in den mit denselben Enzymen verdauten pLAM12-Vektor kloniert. Das Plasmid pLAM-MenA1 wurde dann als Matrize verwendet, um die pLAM-MenA1-L12R-, L14R-, V19R-, L12/V19R- oder L14/V19R-Substitutionen durch ortsspezifische QuikChange-Mutagenese unter Verwendung geeigneter Primer zu konstruieren. Verkürzte MenA1 N1-32 und N1-52 wurden aus pLAM-MenA1 unter Verwendung der Primer Rv0078B NdeI-For und Rv0078B N1-32 EcoRI-Rev bzw. Rv0078B NdeI-For und Rv0078B N1-52 EcoRI-Rev amplifiziert und in pLAM kloniert Vektor verdaut mit NdeI/EcoRI.

Die in dieser Arbeit verwendeten pET15b-Vektorderivate wurden wie folgt konstruiert. Um pET15b-MenT1His zu konstruieren, wurde rv0078A aus pK6-MenT1 verdaut und als NdeI/BamHI-Fragment in pET15b kloniert, das mit denselben Enzymen verdaut wurde. Das Plasmid pET15b-MenT1His wurde als Vorlage für die Konstruktion der D41A-Substitution von pET15b-MenT1His durch QuickChange verwendet. Für pET-MenA1His (MenA1 mit einem N-terminalen His6-Ser-Ser-Gly-Tag) wurde rv0078BHis aus der p29-MenA1-Matrize unter Verwendung der Primer Rv0078BHis NcoI-For und Rv0078BHis BamHI-Rev PCR-amplifiziert und als NcoI/BamHI kloniert Fragment in pETDuet-1, verdaut mit den gleichen Enzymen.

Die Plasmide pUC57-T7-His-HDV, pUC57-T7-Leu-3-HDV, pUC57-T7-Met-2-HDV und pUC57-T7-Ser-4-HDV enthalten eine tRNA-HDV-Fusion unter der Kontrolle eines T7 Promotor wurden von Genewiz (Azenta Life Sciences) synthetisiert. Die Sequenzen der T7-His-HDV-, T7-Leu-3-HDV-, T7-Met-2-HDV- und T7-Ser-4-HDV-Fragmente sind in der Ergänzungstabelle S1 angegeben. Um eine DNA-Matrize für die Transkription mit T7-Polymerase vorzubereiten, wurden T7-tRNA-HDV-Fragmente mittels PCR unter Verwendung der Primer T7-For und HDV-Rev für T7-His-HDV und T7-Met-2-HDV oder HDV short-Rev für T7-HIS-HDV amplifiziert. Leu-3-HDV und T7-Ser-4-HDV. T7-Gly-3-HDV, T7-Gly-3∆A-HDV, T7-Gly-3∆CA-HDV, T7-Gly-3∆CCA-HDV und T7-Gly-3∆TCCA-HDV wurden von konstruiert In-Fusion-PCR und die Primer sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt. Um T7-Gly-3CAA-HDV, T7-Gly-3CTA-HDV, T7-Gly-3CGA-HDV, T7-Gly-3ACA-HDV, T7-Gly-3TCA-HDV und T7-Gly-3GCA-HDV zu erhalten, Die entsprechenden Mutationen des Plasmids pGMC-T7-Gly-3-HDV wurden durch Quickchange unter Verwendung von pGMC-T7-Gly-3-HDV als Matrize konstruiert, die nach PCR-Amplifikation von T7-Gly-3-HDV mit den Primern T7-Gly-3 erhalten wurde -HDV In-Fusion-For und T7-Gly-3-HDV In-Fusion-Rev unter Verwendung von T7-Gly-3-HDV als Matrize und durch homologe Rekombination in linearisiertes pGMCS-Plasmid unter Verwendung von In-Fusion HD Cloning Kits (Takara Bio) kloniert ).

Um die Plasmide pTRB617 (MenA1) und pTRB629 (MenT1) für die Proteinexpression zu konstruieren, wurde die Ligation Independent Cloning (LIC)-Stelle zunächst aus dem Plasmid pSAT1-LIC25 unter Verwendung der Primer TRB1460/TRB1462 (Ergänzungstabelle S1) amplifiziert und in pBAD3067 eingefügt Plasmid pTRB550. Das RV0078B-Gen wurde dann durch PCR von M. tuberculosis H37RV-Genom-DNA unter Verwendung von Primern TRB1699/trb1700 amplifiziert, und RV0078a wurde amplifiziert, die von PET-Ment1HIs unter Verwendung von PET-Ment1his amplifiziert wurden, und beide Coding-Sequenzen wurden durch PTRB61-Sequenzen gekloniert und durch PTRB61-Sequenzen, die durch LIC-In-In-Ptrb550 bis zu werden, und Ptrb617 wurde durch PTRBS-Sequenzen geklont und durch PTRB617 und durch PTRB617 und durch PTRBS-Sequenzen und durch PTRB617 wurden PTRBS-Sequenzen und durch Ptrb550 bis zu Greating und Greating und Greating durchgesetzt. , jeweils. Der pTRB550-Expressionsvektor fügt einen spaltbaren N-terminalen His6-SUMO-Tag hinzu.

In-vivo-Toxizitätstests in E. coli wurden wie folgt durchgeführt. E. coli DLT1900 wurde in LB-Medium bei 37 °C gezüchtet, mit pMPMK6-Vektor oder pK6-MenT1 und p29SEN-Vektor oder p29-MenA1 co-transformiert und über Nacht bei 37 °C auf LB Km, Ap, Glu-Agarplatten gezüchtet . Die Transformanten wurden bis zur mittleren logarithmischen Phase in LB Km Ap-Medium aufgetragen, seriell verdünnt und auf LB Km Ap-Agarplatten mit oder ohne L-Ara und/oder IPTG getupft. Die Platten wurden bei 37 °C inkubiert. In-vivo-Toxizitätstests bei M. smegmatis wurden wie folgt durchgeführt. Kulturen des Stammes mc2155, die in LB-Medium bei 37 °C gezüchtet wurden, wurden mit dem integrativen pGMC-Vektor pGMC-MenT1 und mit dem pLAM12-Vektor pLAM-MenA1 co-transformiert und auf LB-Km-Sm-Agarplatten für 3 Tage bei 37 °C selektiert in Gegenwart oder Abwesenheit von Atc (100 ng.ml−1) und Ace (0,2 %) für die Toxin- bzw. Antitoxin-Expression. Toxizitätstests für M. tuberculosis wurden wie folgt durchgeführt. Die M. tuberculosis-Stämme H37Rv oder H37RvΔ(menA1-menT1)::ZeoR wurden durch Elektroporation mit ~50 ng der Plasmide pGMCS-Vektor, pGMC-MenA1-MenT1, pGMC-MenT1 oder pGMC-MenT1-Varianten mit T39A, D41A, K137A oder transformiert D152A-Ersetzungen. Nach 3 Tagen phänotypischer Expression in 7H9 ADC Tween bei 37 °C wurde der Transformationsmix in zwei Hälften geteilt. Eine Hälfte wurde auf 7H11 OADC mit Sm ausplattiert und die andere Hälfte wurde auf demselben Medium, ergänzt mit Atc (200 ng.ml−1), ausplattiert. Die Platten wurden nach 20 Tagen Inkubation bei 37 °C belichtet.

Um MenT1 und seine Derivate zu reinigen, wurde der mit pET15b-MenT1His transformierte Stamm BL21(λDE3) AI bis zu einer OD600 von ~0,4 bei 37 °C gezüchtet, 0,2 % L-ara wurden zugegeben und die Kultur sofort über Nacht bei 22 °C inkubiert. Die Kulturen wurden 10 Minuten lang bei 4 °C und 5000 × g zentrifugiert, die Pellets wurden in Lysepuffer (20 ml für 1 Liter Zellkultur) resuspendiert und 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Lyse wurde mit dem One-Shot-Zellaufschlussgerät bei 1,5 KBar (One-Shot-Modell, Constant Systems Ltd) durchgeführt. Die Lysate wurden 30 Minuten lang bei 30.000 × g bei 4 ° C zentrifugiert und die resultierenden Überstände vorsichtig mit Ni-NTA-Agarosekügelchen (Qiagen) gemischt, die mit Lysepuffer (25 mM Na-P, 200 mM NaCl, 20 mM Imidazol) voräquilibriert waren ) bei 4 °C für 30 Minuten in einer 10 ml Poly-Prep-Säule (Bio-Rad). Anschließend wurde die Säule 10 Minuten lang bei 4 °C stabilisiert, dreimal mit 10 ml Lysepuffer gewaschen und die Proteine ​​mit Elutionspuffer (25 mM Na-P, 200 mM NaCl, 250 mM Imidazol) eluiert. 500 µl Elutionen wurden gesammelt und PD MiniTrap G-25-Säulen (GE Healthcare) wurden zum Pufferaustausch (25 mM Na-P, 200 mM NaCl, 10 % Glycerin) verwendet und die Proteine ​​wurden unter Verwendung von Vivaspin 6-Säulen mit einem Cut-off von 5000 Da konzentriert (Sartorius). Um den His-Tag zu entfernen, wurde Thrombin mit dem Protein über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach der Zugabe von NTA und Streptavidin wurden der gespaltene His-Tag und das Thrombin ausgewaschen. Die Proteine ​​wurden bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert.

Zur Expression von MenA1 und MenT1 zur Kristallisation wurde E. coli BL21 (λDE3) ΔslyD mit pTRB617 bzw. pTRB629 transformiert. Einzelne Kolonien wurden verwendet, um 25 ml mit Ap ergänztes LB zu inokulieren und über Nacht bei 37 °C und 200 U/min zu züchten. Für Expressionen im großen Maßstab wurden über Nacht Starterkulturen im Verhältnis 1:100 v/v in 12 × 2-L-Kolben mit Schikanen, die 1 L 2xYT und Ap enthielten, erneut ausgesät. Die Zellen wurden zunächst bei 37 °C unter Schütteln mit 175 U/min gezüchtet, bis eine OD600 von 0,3 erreicht wurde. Anschließend wurde die Temperatur auf ~25 °C gesenkt, bis die Expressionskultur eine OD600 von 0,55 erreichte. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Temperatur auf 16 °C gesenkt, L-Ara (0,1 % w/v) zugegeben, um die Proteinexpression zu induzieren, und die Kultur wurde über Nacht unter Schütteln bei 175 U/min gezüchtet. Die Zellen wurden dann 30 Minuten lang bei 4 ° C und 4200 × g pelletiert. Zellpellets wurden in 50 ml eiskaltem A500 (20 mM Tris-HCl pH 7,9, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazol und 10 % Glycerin) resuspendiert, mittels Ultraschall lysiert und dann durch Zentrifugation bei 45.000 × g und 4 °C geklärt für 30 Min. Alle geklärten Zelllysate wurden über eine 5-ml-HisTrap-HP-Säule (Cytiva) geleitet und mit 50 ml A500 gewaschen, gefolgt von zehn Säulenvolumina A100 (20 mM Tris-HCl pH 7,9, 100 mM NaCl, 10 mM Imidazol und 10 mM). % Glycerin), dann direkt auf einer HiTrap Q HP-Anionenaustauschchromatographiesäule (AEC) (Cytiva) mit B100 (20 mM Tris-HCl pH 7,9, 100 mM NaCl, 250 mM Imidazol und 10 % Glycerin) eluiert. Die Q HP-Säule wurde auf ein Äkta Pure (Cytiva) übertragen, mit 3 Säulenvolumina A100 gewaschen, dann wurden die Proteine ​​unter Verwendung eines Gradienten von 100 % A100 bis 100 % C1000 (20 mM Tris-HCl pH 7,9, 1000 mM NaCl, 10 mM Imidazol und 10 % Glycerin). Äkta-Fraktionen, die das Zielprotein enthielten, wie durch den AEC-Chromatogramm-Peak angezeigt, wurden zunächst durch SDS-PAGE analysiert und verifiziert. Diese wurden dann gepoolt und über Nacht bei 4 °C mit humaner Sentrin/SUMO-spezifischer Protease 2 (hSENP2) inkubiert, um den His6-SUMO-Tag vom Zielprotein abzuspalten. Am nächsten Tag wurde die Probe durch eine zweite HisTrap HP-Säule geleitet und der Durchfluss mit unmarkiertem Zielprotein wurde gesammelt. Vor der Reinigung durch Größenausschlusschromatographie (SEC) wurden die MenA1-Antitoxin- und MenT1-Toxinproben jeweils in zwei Teile geteilt. Jeweils eine Probe von MenA1 und MenT1 wurde direkt gemischt und über Nacht bei –4 °C co-inkubiert. Die MenT1-Probe und die gemischten MenA1-MenT1-Proben wurden dann konzentriert und über eine mit dem Äkta Pure verbundene HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 SEC-Säule (Cytiva) unter Verwendung von Größenbestimmungspuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,9, 500 mM) laufen gelassen KCl und 10 % Glycerin). Äkta-Fraktionen, die dem SEC-Chromatogramm-Peak entsprachen, wurden durch SDS-PAGE analysiert, es wurde bestätigt, dass sie Zielprotein(e) enthielten, dann wurden sie gepoolt und konzentriert. Gereinigtes Protein wurde entweder in flüssigem N2 zur Lagerung bei –80 °C schockgefroren oder über Nacht bei 4 °C in Kristallpuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,9, 200 mM NaCl und 2,5 mM DTT) für kristallographische Untersuchungen dialysiert. Kristallisationsproben wurden mit einem NanoDrop 2000-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert und auf Eis gelagert und dann entweder sofort verwendet oder zur Lagerung bei –80 °C in flüssigem N2 schockgefroren. Gefrorene Kristallisationsproben bildeten auch mindestens 15 Monate nach der Lagerung noch verwendbare Kristalle. Gereinigtes MenT4 wurde wie zuvor beschrieben erhalten25.

MenA1:MenT1- und MenT1-Proteinproben wurden auf 12 mg.ml-1 in Kristallpuffer (siehe oben) konzentriert und Kristallisationsscreens wurden mit einem Mosquito Xtal3-Roboter (SPT Labtech) durchgeführt, wobei 200:100 nl und 100:100 nl Protein eingestellt wurden: Zustand sitzende Tropfen. Nach dem ersten Screening bildete MenA1:MenT1 einen einzelnen großen quaderförmigen Kristall in der Bedingung F1 (0,2 M Natriumfluorid, 0,1 M Bis-Tris-Propan pH 6,5 und 20 % w/v PEG 3350) von PACT Premier Eco HT-96 (Molekulare Abmessungen). und MenT1 bildeten dünne quadratische Kristalle unter den Bedingungen E8 (1,8 M Lithiumsulfat und 0,1 M Tris pH 7,5) und G8 (1,8 M Lithiumsulfat und 0,1 M Tris pH 8,5) von Clear Strategy II Eco HT-96 (Molecular Dimensions). Zur Ernte wurden 20 μl Konditionsreservoir zu 20 μl Kryo-Puffer (25 mM Tris-HCl pH 7,9, 187,5 mM NaCl, 3,125 mM DTT, 80 % Glycerin) gegeben und durch Vortexen schnell gemischt; Diese Mischung wurde dann im Verhältnis 1:1 v/v zum Proteinkristalltropfen gegeben. Nach der Zugabe des Kryoschutzmittels wurden die Kristalle sofort mit einer Nylonschlaufe extrahiert und in einen in flüssigem N2 gelagerten Uni-Puck überführt.

Beugungsdaten wurden an der Diamond Light Source an den Strahllinien I24 (MenT1) und I04 (MenA1:MenT1) gesammelt, wobei der Client „Generic Data Acquisition“ (opengda.org) von Diamond Light Source und iSpyB (R2.3) zur Visualisierung der Daten verwendet wurden. Für MenT1 wurde ein einzelner 720°-Datensatz bei 0,9795 Å erfasst. Zwei 360°-Datensätze wurden für MenA1:MenT1 bei 0,9795 Å gesammelt und mit iSpyB (Diamond Light Source) zusammengeführt. Beugungsdaten wurden mit XDS68 verarbeitet und anschließend wurde AIMLESS von CCP469 verwendet, um die Raumgruppen zu bestätigen. Die Kristallstruktur von MenA1:MenT1 wurde von Anfang an mit ARCIMBOLDO70 gelöst. Die MenT1-Struktur wurde von PHASER MR71 gelöst, wobei MenT1α aus der MenA1:MenT1-Struktur als Suchmodell verwendet wurde. Alle gelösten Kristallstrukturen wurden mit BUCCANEER72 und REFMAC in CCP469 weiter aufgebaut, dann iterativ verfeinert und mit PHENIX73 bzw. COOT74 aufgebaut. Die Qualität des endgültigen Modells wurde mithilfe von COOT und dem wwPDB-Validierungsserver75 bewertet. Strukturfiguren, einschließlich Ausrichtungen und Überlagerungen, wurden mit PyMol76 generiert.

Ein zellfreier Transkriptions-/Translations-gekoppelter Assay (PURE-System, Proteinsynthese unter Verwendung rekombinanter Elemente, NEB) wurde verwendet, um die Wirkung des MenT1-Toxins und seiner Derivate auf die Proteinsynthese zu überwachen, wie für MenT325 beschrieben. Die Matrizen-DNA von gfp77 und waaF (P37692) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers in Gegenwart oder Abwesenheit des Toxins separat zum PURE-System hinzugefügt. Die Proteinsynthese wurde 2 Stunden lang bei 37 °C durchgeführt, die Proben wurden auf SDS-PAGE (4–20 % Miniprotein-TGX-Gele von Bio-Rad) aufgetrennt und durch Autoradiographie (WaaF) oder Western Blots (GFP) analysiert. Im Fall von GFP wurden die Blots mit monoklonalem Anti-GFP-Antikörper (ThermoFisher MA5-15256; Verdünnung 1/3000) sondiert und mit HRP-konjugiertem Anti-Maus-IgG (H + L)-Sekundärantikörper (Promega W4021; Verdünnung 1/3000) nachgewiesen. 2500) und mit der Image Lab-Software (Bio-Rad) visualisiert. Um MenT1 mit tRNA vorzuinkubieren, wurde ein PURExpress Δ(aa, tRNA)-Kit (NEB, E6840S) verwendet. 0,33 µl tRNA aus dem Kit wurden mit 0, 2,5, 5, 10 µM MenT1 3 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, dann wurde der Test gemäß der Anleitung durchgeführt, mit der Ausnahme, dass 1,5 µl vorinkubierte tRNA in einer 5 µl-Reaktion verwendet wurden Volumen.

tRNAs wurden nach In-vitro-Transkription von PCR-Matrizen erhalten, die eine integrierte T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz enthielten. Primer für M. tuberculosis-tRNAs sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt. Die In-vitro-Transkriptionsreaktionen der T7-RNA-Polymerase wurden in einem Gesamtvolumen von 25 µl mit einer 5 µl-Nukleotidmischung aus 2,5 mM NTPs (Promega) durchgeführt. Pro Reaktion wurden 50 bis 100 ng Matrize mit 1,5 µl rRNasin 40 U.ml-1 (Promega), 5 µl 5x optimiertem Transkriptionspuffer (Promega), 2 µl T7-RNA-Polymerase (20 U.ml-1) und 2,5 µl verwendet 100 mM DTT bei 37 °C für 2 h25. Die tRNA-Produkte wurden mit Trizol78 isoliert und in einer Endkonzentration von 100 bis 200 ng.µl−1 gelagert, wie von NanoDrop überwacht.

Die MenT1-NTase-Aktivität wurde in 10 µl Reaktionsvolumina, die 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl2 und 1 µCi.µl−1 radioaktiv markierter rNTPs [α−32P] (Hartmann Analytic) enthielten, getestet und 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert . 100 ng in vitro transkribiertes tRNA-Produkt, synthetisierter Akzeptorstamm von tRNA Gly-3 oder Mutationen (RNA-Sequenz wurde in Abb. 4F, GenScript angegeben), 1 µg Gesamt-RNA oder 100 ng E. coli-tRNA wurden pro Assay mit 5 µM verwendet Protein. Die 10-µl-Reaktionen wurden mit Bio-Spin® 6-Säulen (Bio-Rad) gereinigt und mit 10 µl RNA-Beladungsfarbstoff (95 % Formamid, 1 mM EDTA, 0,025 % SDS, Xylolcyanol und Bromphenolblau) gemischt und denaturiert 90 °C erhitzt und auf 6 % Polyacrylamid-Harnstoff-Gelen aufgetrennt. Das Gel wurde bei 80 °C vakuumgetrocknet, einem Phosphorimager-Bildschirm ausgesetzt und durch Autoradiographie mit einem Typhoon-Phosphorimager (GE Healthcare) sichtbar gemacht.

Eine optimierte Version des Hepatitis-Delta-Virus (HDV)-Ribozyms wurde verwendet, um wie beschrieben homogene tRNA-3′-Enden zu erzeugen79. Kurz gesagt, die DNA-Matrize T7-tRNA-HDV wurde aus dem Plasmid pUC-57Kan-T7-tRNA-HDV (Ergänzungstabelle S1) amplifiziert, mit der Ausnahme, dass T7-tRNA Gly-3-HDV durch In-Fusion-PCR amplifiziert wurde. Markierte oder unmarkierte tRNAs wurden durch In-vitro-Transkription von PCR-Matrizen unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase hergestellt. Die T7-RNA-Polymerase-In-vitro-Transkriptionsreaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 25 µl mit einer 5 µl Nukleotidmischung aus 2,5 mM ATP, 2,5 mM UTP, 2,5 mM GTP, 60 µM CTP (Promega, 10 mM Stammlösung) und 2–4 µl durchgeführt 10 mCi.ml−1 radioaktiv markiertes CTP [α−32P] oder mit 5 µl Nukleotidmischung aus 2,5 mM ATP, 2,5 mM UTP, 2,5 mM GTP, 2,5 mM CTP für unmarkierte tRNA-Transkription. Pro Reaktion wurden 50 bis 100 ng Matrize mit 1,5 µl rRNasin 40 U.ml-1 (Promega), 5 µl 5x optimiertem Transkriptionspuffer (Promega), 2 µl T7-RNA-Polymerase (20 U.ml-1) und 2,5 µl verwendet 100 mM DTT. Nicht eingebaute Nukleotide wurden mit Micro Bio-Spin 6-Säulen (Bio-Rad) gemäß den Anweisungen des Herstellers entfernt. Die Transkripte wurden auf einem denaturierenden 6 %igen Acrylamidgel gelgereinigt und über Nacht bei 20 °C in 0,3 M Natriumacetat eluiert. Der Überstand wurde entfernt, mit Ethanol präzipitiert und in 14 µl nukleasefreiem Wasser resuspendiert. Radioaktiv markierte tRNAs, die am 3'-Ende ein zyklisches 2′,3′-Phosphat trugen, wurden unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase (NEB) in 100 mM Tris-HCl, pH 6,5, 100 mM Magnesiumacetat und 5 mM β-ME in einem Endvolumen von dephosphoryliert 20 µl für 6 h bei 37 °C. Alle Tests wurden mit Micro Bio-Spin 6-Säulen (Bio-Rad) entsalzt.

Die MenA1-Antitoxinaktivität wurde unter Verwendung der in vitro transkribierten tRNA Gly-3 als Substrat getestet. Für den Co-Inkubationstest wurden MenT1 (5 µM) und steigende Molverhältnisse von MenA1 mit tRNA Gly-3 und 1 mM CTP in 10 µl Reaktionsvolumina, die 20 mM Tris-HCl pH 8,0 und 10 mM MgCl2 enthielten, 4 Stunden lang bei inkubiert 37 °C.

Das tRNA-Screening wurde mit 100 ng M. tuberculosis-tRNAs durchgeführt. Die Aktivität wurde in 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl2 und 1 mM CTP in 10 µl Reaktionsvolumina getestet und 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Transkripte wurden mit 5 µM MenT1 oder mit nukleasefreiem Wasser als Kontrolle inkubiert. Die Reaktion wurde mit 10 µl RNA-Beladungsfarbstoff (95 % Formamid, 1 mM EDTA, 0,025 % SDS, Xylolcyanol und Bromphenolblau) gestoppt, bei 90 °C denaturiert und auf 6 % Polyacrylamid-Harnstoff-Gele aufgetragen. Das Gel wurde bei 80 °C vakuumgetrocknet und einem Phosphorimager-Bildschirm ausgesetzt, der durch Autoradiographie mit einem Typhoon-Phosphorimager (GE Healthcare) sichtbar gemacht wurde.

Die für die tRNA-Bibliothek verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle S1 beschrieben. Um die MenT1-Bibliothek zu erhalten, wurden 5 µg Gesamt-RNA von M. smegmatis mit 1 mM CTP mit Wasser, 10 µg MenT1 WT oder MenT1 D41A für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Für die in vitro transkribierte tRNA-Seq wurden 15 ng spezifische tRNA mit 5 µM MenT1 WT oder MenT1 D41A (1,3 µg) 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Um die MenT4-Bibliothek zu erhalten, wurden 5 µg Gesamt-RNA von M. smegmatis mit 1 mM GTP mit Wasser und 10 µg MenT4 WT für 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Gesamt-RNA-Proben und einzelne tRNA-Proben wurden mittels Trizol- bzw. Ethanol-Fällung isoliert. Um m1A-, m3C- und m1G-Modifikationen in den tRNAs zu entfernen, wurden die gesamten RNA-Proben mit dem Demethylase-Kit (Arraystar, Kat.-Nr.: AS-FS-004, Rockville, MD, USA) vorbehandelt und anschließend mit Trizol isoliert. Das 3p-v4-Oligo wurde mit dem 5'-DNA-Adenylierungskit (E2610S, NEB) gemäß dem Protokoll 5'-adenyliert. Um die Bibliothek aufzubauen, wurden RNA-Proben an die adenylierten 3p-v4-Adapter ligiert und die umgekehrte Transkription wurde mit dem ProtoScript II RT-Enzym (NEB) unter Verwendung eines Barcode-Primers durchgeführt (Ergänzungstabelle S1). Schließlich wurde die PCR-Amplifikation mit tRNAs oligoFor mix und A-PE-PCR10 (nach 5 Zyklen wurde das Programm angehalten und B_i7RPI1_CGTGAT oder i7RPI7_GATCTG hinzugefügt) unter Verwendung von Q5 Polymerase Hot-Start (NEB) durchgeführt. Die Bibliothek wurde mit dem DNBSEQ-G400RS High-throughput Sequencing Set (PE100) bei BGI Genomics (Hongkong) sequenziert.

Nach einer Qualitätsprüfung wurden die Lesevorgänge demultiplext, um eine Fastq-Datei pro Versuchsbedingung zu erhalten. Für jede Versuchsbedingung wurde das gleiche Verfahren angewendet: (i) Zuordnung zu einer Referenz, (ii) Entfernung von PCR-Duplikaten, (iii) Quantifizierung der Lesezahlen. Die Qualität der Rohlesevorgänge wurde mit FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc) überprüft. Die weitere Leseverarbeitung wurde mit der R-Softwareversion 4.1.1 und BioConductor-Bibliotheken zur Verarbeitung der erhaltenen Sequenzierungsdaten durchgeführt. Zur Verarbeitung von Fastq-Dateien wurde die R-Bibliothek ShortRead 1.50.080 verwendet. Rsubread 2.6.481 wurde verwendet, um Lesevorgänge im Referenzgenom abzubilden. Eine weitere Filterung wurde durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Lesevorgänge die aus der Bibliotheksvorbereitung resultierende Struktur enthielten (Ergänzungstabelle S1 für die RNA-Seq-Lesestruktur): Lesevorgänge beginnen mit einem zufälligen Nukleotid an Position 1, einem gültigen Barcode an Position 2–5 und einer Erkennungssequenz, die sich daraus ergibt Ligation an Position 6–24, wobei eine Fehlpaarung zulässig ist, zufällige UMI-Sequenz an Position 25–39, Agacat-Kontrollsequenz an Position 40–45 und eine Nukleotidsequenz an Position 46–100, die dem umgekehrten Komplement des ligierten 3′- Ende der tRNAs im Experiment. Lesevorgänge, die den verschiedenen durch den Barcode identifizierten experimentellen Bedingungen entsprachen, wurden für unabhängige weitere Analysen (Kartierung und Quantifizierung) in Fastq-Dateien demultiplext.

Alle chromosomalen tRNA-Gensequenzen von M. smegmatis mc2155 (NC_008596.1) wurden in einer Multifasta-Datei extrahiert. Die Sequenz der Gene rrfA, CspA und tmRNA wurde ebenfalls hinzugefügt. Zwei zusätzliche Sequenzen wurden hinzugefügt, die der tmRNA und der tRNA16-GlyTCC von M. tuberculosis H37RV (NC_000962.3) entsprechen. Die Nukleotide CCA wurden am Ende jeder Sequenz verkettet. Die Lesevorgänge wurden vor dem Versuch, sie an Referenzsequenzen auszurichten, nur auf die RNA-Sequenz von Position 46 bis 100 gekürzt. Das Mapping auf Referenzsequenzen wurde unter Verwendung der Bibliothek Rsubread 2.8.2 mit Parametern durchgeführt, die sicherstellen, dass der Lesevorgang ohne Fehlanpassung oder Indel einer eindeutigen Region zugeordnet wird: unique = TRUE, type = 'dna', maxMismatches = 0, indels = 0, ouput_format = 'BAM'.

Zur Quantifizierung wurden SAM-Dateien mit Rsamtools 2.8.0 (https://bioconductor.org/packages/Rsamtools) verarbeitet, um die Anzahl der Lesevorgänge zu zählen, die aufgrund von RNA 3 derselben Region in Referenzsequenzen mit denselben nicht kartierten 3'-Sequenzen zugeordnet sind ′ Endänderungen. Die Lesevorgänge wurden beibehalten, wenn die gesamte Sequenz kartiert war oder wenn nur das 3′-Ende nicht kartiert war, was den durch das Toxin hinzugefügten Nukleotiden entspricht. In den Alignments in der SAM-Datei ergibt sich daraus ein CIGAR-Code mit nur „M“-Zeichen (was auf eine Übereinstimmung hinweist), möglicherweise gefolgt von „S“-Zeichen (was darauf hinweist, dass keine Ausrichtung auf die Referenzsequenz vorliegt). Die Mindestlänge der kartierten Region wurde auf 20 festgelegt. PCR-Duplikate wurden unter Verwendung des UMI entfernt, das in der Bibliotheksvorbereitung für Lesevorgänge eingeführt wurde, die genau dieselbe Region abbilden (gleicher Anfang und Ende des Alignments) und genau dieselbe nicht kartierte 3'-Endsequenz aufweisen. Nach diesen Vorverarbeitungsschritten wurden die Lesevorgänge nach ihrer 3'-End-Kartierungsposition und der Sequenz der nicht kartierten 3'-Endregion neu gruppiert, um ihre Häufigkeit im Hinblick auf dasselbe tRNA-3'-Ende, gefolgt von denselben Nukleotiden, dh denselben posttranskriptionellen Modifikationen, zu quantifizieren. Um Rauschen zu beseitigen, wurde eine tRNA mit ihren posttranskriptionellen Modifikationen nur dann behalten, wenn sie unter mindestens einer der Versuchsbedingungen mindestens zehnmal gefunden wurde.

Biologische Replikate und Gesamtablesungen aller tRNA-seq-Experimente sind im ergänzenden Datenblatt 1 und unbeschnittene Gele in der Quelldatendatei angegeben.

Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurde keine statistische Methode verwendet. Es wurden keine Daten von den Analysen ausgeschlossen. Die Experimente waren nicht randomisiert. Die Forscher waren während der Experimente und der Ergebnisbewertung nicht blind für die Zuordnung.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Kristallstrukturen des MenT1-Apo und des MenAT1-Komplexes wurden in der Proteindatenbank unter den Zugangsnummern 8AN4 bzw. 8AN5 hinterlegt. Alle anderen Daten, die zur Bewertung der Schlussfolgerungen im Papier erforderlich sind, sind im Papier und/oder in den ergänzenden Daten enthalten. RNA-Seq-Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, wurden im European Nucleotide Archive (ENA) am EMBL-EBI unter der Zugangsnummer PRJEB62085 hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Arbeit wurde durch einen Springboard Award (SBF002\1104) der Academy of Medical Sciences an BU und TRB unterstützt; das Centre National de la Recherche Scientifique, Université Paul Sabatier, Agence Nationale de la Recherche (ANR-19-CE12-0026) an ON und PG; das Program d'Investissements d'Avenir (ANR-20-PAMR-0005) an ON und PG; die National Natural Science Foundation of China, (32000021) bis XX; ein Stipendium des China Scholarship Council (CSC) im Rahmen eines gemeinsamen internationalen PhD-Programms mit der Universität Toulouse Paul Sabatier und ein Stipendium der Fondation pour la Recherche Médicale (FDT202304016729) an XH; der Schweizerische Nationalfonds (CRSII3_160703) an PG; ein Stipendium des Engineering and Physical Sciences Research Council Molecular Sciences for Medicine Center for Doctoral Training (EP/S022791/1) an TJA. Wir danken Yiming Cai und Léonora Poljak für ihre Unterstützung und Beratung im Verlauf dieser Studie. Wir danken Diamond Light Source für die Zeit an den Strahllinien I24 und I04 im Rahmen des Vorschlags MX24948.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Xibing Xu, Ben Usher.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Tim R. Blower, Pierre Genevaux.

Labor für Mikrobiologie und Molekulargenetik (LMGM), Zentrum für Integrative Biologie (CBI), Universität Toulouse, CNRS, Universität Toulouse III – Paul Sabatier (UT3), Toulouse, Frankreich

Xibing Xu, Roland Barriot, Xue Han, Peter Redder und Pierre Genevaux

Abteilung für Biowissenschaften, Durham University, South Road, Durham, DH1 3LE, Großbritannien

Ben Usher, Tom J. Arrowsmith und Tim R. Blower

Institut für Pharmakologie und Strukturbiologie (IPBS), Universität Toulouse, CNRS, Universität Toulouse III – Paul Sabatier (UT3), Toulouse, Frankreich

Claude Gutierrez und Olivier Neyrolles

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Analysierte Daten: XX, BU, CG, RB, TJA, XH, PR, ON, TRB und PG Entworfene Forschung: XX, BU, CG, RB, TJA, , CG, RB, TJA, XH Verfasser des Artikels: XX, TRB und PG mit Beiträgen aller Autoren. Finanzierungseinwerbung: XX, ON, TRB und PG. Betreuung der Studie: TRB und PG

Korrespondenz mit Tim R. Blower oder Pierre Genevaux.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Xu, X., Usher, B., Gutierrez, C. et al. MenT-Nukleotidyltransferase-Toxine verlängern tRNA-Akzeptorstämme und können durch asymmetrische Antitoxinbindung gehemmt werden. Nat Commun 14, 4644 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40264-3

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Eingegangen: 28. Februar 2023

Angenommen: 20. Juli 2023

Veröffentlicht: 17. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40264-3

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