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Jul 15, 2023

Kationisch

npj Vaccines Band 8, Artikelnummer: 106 (2023) Diesen Artikel zitieren 389 Zugriffe 3 Altmetric Metrics Details Das Respiratory Syncytial Virus (RSV) ist eine der Hauptursachen für Erkrankungen der oberen und unteren Atemwege

npj Vaccines Band 8, Artikelnummer: 106 (2023) Diesen Artikel zitieren

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3 Altmetrisch

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Das Respiratory Syncytial Virus (RSV) ist eine der Hauptursachen für Infektionen der oberen und unteren Atemwege, insbesondere bei Kindern und älteren Menschen. Verschiedene Impfstoffe, die die wichtigsten Transmembranoberflächenproteine ​​des RSV (Proteine ​​F und G) enthalten, wurden getestet; Sie bieten jedoch entweder keinen ausreichenden Schutz oder sind mit dem Risiko einer durch Impfungen verstärkten Erkrankung (VED) verbunden. Kürzlich haben F-Protein-basierte Mütterimmunisierungen und Impfstoffe für ältere Patienten in klinischen Phase-III-Studien vielversprechende Ergebnisse gezeigt, diese Impfstoffe wurden jedoch durch Injektion verabreicht. Hier untersuchten wir das Potenzial der Verwendung der Ektodomäne des kleinen hydrophoben Proteins (SHe), ebenfalls ein RSV-Transmembranoberflächenprotein, als nasales Impfstoffantigen. Ein Impfstoff wurde unter Verwendung unseres zuvor entwickelten kationischen Cholesteringruppen tragenden Pullulan-Nanogels als Abgabesystem formuliert und SHe wurde dreifach an Pneumokokken-Oberflächenprotein A als Trägerprotein gebunden. Die nasale Immunisierung von Mäusen und Baumwollratten induzierte sowohl SHe-spezifische Serum-IgG- als auch Schleimhaut-IgA-Antikörper und verhinderte so die Virusinvasion sowohl in den oberen als auch in den unteren Atemwegen, ohne VED auszulösen. Darüber hinaus induzierte die nasale Immunisierung eine stärkere schützende Immunität gegen RSV in den oberen Atemwegen als die systemische Immunisierung, was darauf hindeutet, dass mukosale RSV-spezifische IgA-Reaktionen eine entscheidende Rolle bei der Viruseliminierung am Atemwegsepithel spielen. Somit induzierte unser Nasenimpfstoff einen wirksamen Schutz gegen RSV-Infektionen in der Atemwegsschleimhaut und ist daher ein vielversprechender Impfstoffkandidat für die weitere Entwicklung.

Das Respiratory Syncytial Virus (RSV) ist eine der Hauptursachen für Infektionen der oberen und unteren Atemwege, insbesondere bei Kindern unter fünf Jahren1 und älteren Menschen2. RSV-Bronchiolitis und Lungenentzündung im Säuglingsalter begünstigen die Entwicklung von Asthma und Allergien3. Hochrisikokinder (z. B. solche mit angeborenen Herzfehlern oder Immunschwäche) entwickeln häufig schwere, manchmal tödliche Komplikationen aufgrund einer RSV-Infektion4,5, und das Gleiche gilt für Hochrisiko-Erwachsene6. Derzeit ist das einzige verfügbare Therapeutikum gegen RSV Infektion ist ein humanisierter monoklonaler IgG1-Antikörper, der auf das Fusionsglykoprotein (F) von RSV abzielt und nur für die Anwendung bei Hochrisikokindern zugelassen ist7,8. Es handelt sich außerdem um eine teure, passive Immunisierung, die wiederholte monatliche intramuskuläre Injektionen erfordert und eine wirtschaftliche, physische und psychische Belastung für Patienten, ihre Familien und Gesundheitssysteme darstellt9,10. Daher ist eine aktive Immunisierungsstrategie, ein prophylaktischer RSV-Impfstoff, dringend erforderlich.

In den 1960er Jahren wurden klinische Studien mit einem Formalin-inaktivierten (FI)-RSV-Impfstoff durchgeführt, der neutralisierende Antikörper induzierte; Der Impfstoff bot jedoch keinen ausreichenden Schutz, so dass geimpfte Säuglinge nach einer natürlichen RSV-Infektion anfällig für schwere, manchmal tödliche klinische Komplikationen waren, ein Zustand, der als durch die Impfung verstärkte Krankheit (VED)11,12 bekannt ist. Seitdem wurden viele experimentelle Impfstoffe untersucht, wobei Untereinheiten von zwei der wichtigsten RSV-Oberflächenglykoproteine, Protein F13,14 und das Bindungsglykoprotein (Protein G)13,15, oder lebend abgeschwächtes RSV16,17,18 als Kandidatenantigene verwendet wurden. Kürzlich wurden mehrere vielversprechende Impfstoffkandidaten entwickelt und befinden sich derzeit in der klinischen Prüfung19. Besonders ermutigende Ergebnisse stammen aus den Phase-III-Studien mit Impfstoffen auf F-Protein-Basis20,21,22. Allerdings ist der injizierbare Impfstoff im Allgemeinen weniger wirksam für die Induktion einer schützenden Immunität an der RSV-Invasionstelle der Schleimhautoberfläche der Atemwege, während der nasale Impfstoff nachweislich sowohl mukosale als auch systemische Immunantworten gegen Atemwegserreger induziert23,24,25,26, 27.

Zusätzlich zu den Hauptoberflächen-Glykoproteinen F und G enthält die RSV-Hülle ein weiteres virales Transmembran-Oberflächen-Glykoprotein: das kleine hydrophobe (SH) Protein28,29. Im Vergleich zu Antikörpern gegen die Proteine ​​F und G29 zeigen Antikörper gegen das SH-Protein eine geringere neutralisierende Aktivität30, was höchstwahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass das SH-Protein nicht an der Auslösung einer Virusinfektion beteiligt ist und eine geringe Immunogenität aufweist31. Allerdings wird die RSV-Replikation ohne die Induktion von VED über einen antikörperabhängigen zellulären Zytotoxizitätsmechanismus (ADCC) reduziert, an dem SH-spezifische IgG-Antikörper beteiligt sind30,32. Aufgrund dieser geringeren Induktion der neutralisierenden Aktivität durch das SH-Antigen31,33,34 werden SH-basierte Antigene im Allgemeinen als weniger attraktive Untereinheitsantigene für die RSV-Impfstoffentwicklung angesehen, obwohl sie den Vorteil haben, keine VED zu induzieren.

Zuvor haben wir ein nanometergroßes Hydrogel, ein „Nanogel“, entwickelt, das aus einem kationischen, Cholesteringruppen tragenden Pullulan (cCHP) besteht. Wir haben herausgefunden, dass unser cCHP-Nanogel ein sicheres und wirksames nasales Impfstoffabgabesystem ist, das zur Stimulierung des Immunsystems der Nasenschleimhaut durch den Einsatz verschiedener Antigene der Untereinheiten23,24,25,26,35,36,37 eingesetzt werden kann. Aufgrund seiner kationischen Eigenschaft haftet cCHP-Nanogel dauerhaft an den Oberflächen der negativ geladenen Nasenschleimhaut, was zu einer längeren Freisetzung von Antigenen an die Antigen-Probenahme- und -präsentationssysteme der Nasenschleimhaut führt38.

Da RSV zunächst die Atemwegsschleimhaut infiziert, ist es logisch, nicht nur im systemischen Kompartiment, sondern auch an der Atemwegsschleimhaut (z. B. Nasenhöhle und Lunge) eine schützende Immunität zu verleihen. Wir beschlossen daher, die Sicherheit von SH-basierten Antigenen zu nutzen, indem wir eines mit unserem auf Nanogelen basierenden Impfstoffabgabevehikel kombinierten und einen cCHP-basierten Impfstoff gegen nasale Untereinheiten herstellten, der die Ektodomäne des SH-Proteins (SHe) als Antigen enthielt. Anschließend untersuchten wir, ob der SHe-Nasenimpfstoff auf cCHP-Basis einen wirksamen Schutz in der Atemwegsschleimhaut von Mäusen und Baumwollratten bietet, ohne VED auszulösen, und ob diese Formulierung als wirksamer Impfstoffkandidat für die weitere klinische Entwicklung angesehen werden kann.

Zur Verwendung als Antigen in unserem Nasenimpfstoff verwendeten wir die Peptidsequenz der Ektodomäne des SH-Proteins des RSV-Subtyps A (Abb. 1a). Das Antigen wurde unter Verwendung des Pneumokokken-Oberflächenproteins A (PspA) von Streptococcus pneumoniae als Trägerprotein konstruiert23,25,35,36,37. Da das native SHe-Protein eine geringe Immunogenität aufweist31,33,34, verstärkten wir die Immunogenität des Impfstoffantigens, indem wir drei der SHe-Peptide nacheinander mit dem Trägerprotein verknüpften. Das vollständige Impfstoffantigen wurde unter Verwendung eines Escherichia coli-Expressionssystems erhalten und durch His-Tag-Reinigung gereinigt (Abb. 1b), und seine Aminosäuresequenz wurde durch massenspektrometrische Analyse bestätigt. Anschließend wurde das SHe-PspA-Antigen mit cCHP-Nanogel in einem Antigen:Nanogel-Molverhältnis von 1:1 in Gegenwart oder Abwesenheit von zyklischem Di-AMP (cdAMP) als Adjuvans formuliert und in den anschließenden Nasenimmunisierungsstudien verwendet (Abb. 1c).

Eine massenspektrometrische Analyse ergab, dass das aus Escherichia coli stammende rekombinante Protein die vollständigen Sequenzen von PspA (gelb), dreifachen Linkern (rot), dreifachen Ektodomänen eines kleinen hydrophoben Proteins (grün), einem Vektor (weiß) und einem His-Tag (blau) enthielt ). b Ein chimäres, His-markiertes, PspA-konjugiertes Antigen wurde in Escherichia coli produziert. Das Protein wurde durch Metallchelatchromatographie und anschließende Gelfiltration gereinigt. Gekochte Proben in den Reinigungsstufen wurden durch SDS-PAGE getrennt. Proteinbanden wurden durch Coomassie-Brillantblau-Färbung sichtbar gemacht. Nach der Probenreinigung entdeckten wir ein 44-kDa-Protein, das dem SHe-PspA-Protein entspricht (rote Pfeilspitze). c Schematische Darstellung des Impfstoffdesigns. Drei wiederholte SHe-Sequenzen wurden mit PspA konjugiert, um die Immunogenität des Antigens zu erhöhen.

Um zu untersuchen, ob die Nasenimpfung mit unserem cCHP-basierten SHe-PspA-Antigen (cCHP-[SHe-PspA]) SHe-spezifische Antikörperreaktionen induziert, haben wir SHe-spezifische Antikörpertiter in Serum, Nasenspülflüssigkeit und bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF) bestimmt. gesammelt von Mäusen, die mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, nicht immunisiert), SHe-PspA allein oder cCHP-[SHe-PspA] mit oder ohne cdAMP nasal immunisiert (NI) waren (Abb. 2a und Tabelle 1). Darüber hinaus bestimmten wir die Antikörpertiter in Proben von Mäusen, die intraperitoneal mit SHe-PspA plus unvollständigem Freund-Adjuvans (IFA) oder SHe-PspA allein immunisiert (iPI) waren.

einen Impfplan. Weibliche Wildtyp-BALB/c-Mäuse (WT) wurden dreimal in wöchentlichen Abständen nasal immunisiert und anschließend zweimal in 2-wöchigen Abständen geboostert. Andere WT BALB/c-Mäuse wurden alle drei Wochen insgesamt dreimal intraperitoneal immunisiert. Kontrollmäuse (nicht immunisiert) erhielten phosphatgepufferte Kochsalzlösung, die intranasal verabreicht wurde. b–e SHe-spezifische Antikörpertiter eine Woche nach der letzten Immunisierung in Serum (b), Nasenspülflüssigkeit (d) und bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF) (c, e). Die Daten sind repräsentativ für fünf oder mehr unabhängige Experimente und jede Gruppe bestand aus sieben oder mehr Mäusen. Jeder schwarze Kreis repräsentiert eine einzelne Maus. ND, in unverdünnten Proben nicht nachweisbar. Für die statistische Analyse wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukeys Mehrfachvergleichstest verwendet. NS, nicht signifikant; *p < 0,05; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. Die Werte werden als Mittelwerte ± 1 SD dargestellt.

SHe-spezifische IgG-Titer wurden in Serum und BALF untersucht (Abb. 2b, c). Bei NI-Mäusen mit cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP waren die SHe-spezifischen Serum- und BALF-IgG-Titer signifikant höher als bei NI-Mäusen mit cCHP-[SHe-PspA] oder SHe-PspA allein. Darüber hinaus waren die Serum- und BALF-Titer von Mäusen NI mit cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP genauso hoch wie die von Mäusen iPI mit SHe-PspA+IFA. SHe-spezifische IgA-Titer wurden in Nasenspülung und BALF untersucht (Abb. 2d, e). NI-Mäuse mit cCHP-[SHe-PspA] mit oder ohne cdAMP zeigten sowohl in der Nasenspülung als auch im BALF hohe SHe-spezifische IgA-Titer. Die Mäuse, die die Adjuvans-haltige Formulierung erhielten, zeigten unabhängig vom Verabreichungsweg einen signifikant höheren IgA-Titer als alle anderen Mäuse. Tatsächlich zeigten die Mäuse in den anderen Gruppen eine sehr geringe bis gar keine Induktion der IgA-Produktion. Somit induzierte NI mit cCHP-[SHe-PspA] mit oder ohne cdAMP hohe Titer an SHe-spezifischen Serum-IgG- und Schleimhaut-IgA-Antikörpern. Darüber hinaus wurden bei der Untersuchung der T-Zell-Reaktionen Granzym B- oder Interferon (IFN)-γ-produzierende antigenspezifische T-Zellen in der Lunge, den Halslymphknoten und der Milz von Mäusen induziert, die mit cCHP-[SHe-PspA] immunisiert wurden nasaler Impfstoff (ergänzende Abbildung 1).

Um zu beurteilen, ob die Immunisierung mit cCHP-[SHe-PspA] eine schützende Immunität gegen Infektionen in den oberen und unteren Atemwegen bietet, wurden Mäuse mit PBS, cCHP-[SHe-PspA] oder cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP und NI behandelt dann mit RSV herausgefordert. Darüber hinaus wurden auch Mäuse-iPI mit SHe-PspA+IFA herausgefordert. Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurden Mäuse intratracheal mit 1 × 106 PFU39 mit dem RSV-A2-Stamm in Kontakt gebracht, um die Wirksamkeit des Impfstoffs in der Lunge zu bewerten, oder intranasal mit 1 × 105 PFU40, um die Wirksamkeit des Impfstoffs in den Nasenkompartimenten zu bewerten. Vier Tage nach der Virusbelastung wurde die Viruslast in der Lunge oder im Nasenbereich der Mäuse mittels Immunplaque-Assay untersucht (ergänzende Abbildung 2a). Darüber hinaus wurde der Gehalt an RSV-F- und -G-mRNA durch RT-PCR quantifiziert und zwischen diesen verschiedenen immunisierten Gruppen verglichen.

Da es sich bei den unteren Atemwegen um eine Hauptstelle von Gewebeschäden handelt, die durch eine schwere RSV-Infektion verursacht werden5, untersuchten wir zunächst die Viruslast in der Lunge von NI- oder iPI-Mäusen mit den verschiedenen Impfstoffformulierungen. Die Immunplaque-Analyse ergab, dass NI-Mäuse mit cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP im Vergleich zu denen der nicht immunisierten Mäuse signifikant niedrigere Virustiter aufwiesen und mit denen der anderen immunisierten Mäuse vergleichbar waren (Abb. 3a). Die Viruslast bei den nicht immunisierten Mäusen betrug 6,9 × 105 ± 4,5 × 105. Im Gegensatz dazu wurde mit cCHP-[SHe-PspA] NI, cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP NI oder [SHe-PspA]+IFA iPI immunisiert Mäuse zeigten eine Verringerung der Viruslast (1,9 × 105 ± 1,2 × 105, 9,1 × 104 ± 1,5 × 104 bzw. 6,9 × 104 ± 4,0 × 104 PFU/g). Die RT-PCR-Analyse bestätigte das Immunplaque-Ergebnis (Abb. 3b). Im Nasenkompartiment zeigten sowohl die Immunplaque- als auch die RT-PCR-Analyse, dass NI-Mäuse mit cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP im Vergleich zu denen der anderen Mäuse signifikant niedrigere Virustiter aufwiesen (Abb. 3c, d). Die Viruslast bei den nicht immunisierten Mäusen betrug 5,8 × 104 ± 1,4 × 104. Im Gegensatz dazu wurden die iPI mit cCHP-[SHe-PspA], cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP NI und [SHe-PspA]+IFA immunisiert Mäuse zeigten eine Verringerung der Viruslast (3,7 × 104 ± 1,4 × 104, 4,0 × 10 ± 9,8 × 10 bzw. 5,4 × 103 ± 1,9 × 103 PFU/g). Tatsächlich lag die Viruslast in den Nasenkompartimenten von NI-Mäusen mit cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP fast unter der Nachweisgrenze (4,0 × 10 ± 9,8 × 10 PFU).

a–d Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurden Mäuse intratracheal oder intranasal mit dem RSV-A2-Stamm provoziert, um die Wirksamkeit des Impfstoffs in der Lunge (a, b) bzw. im Nasenbereich (c, d) zu bewerten. Die Virusclearance wurde durch Immunplaque-Assay (a, c) oder Echtzeit-RT-PCR (b, d) bestimmt. Die Daten sind repräsentativ für drei oder mehr unabhängige Experimente und jede Gruppe bestand aus vier oder mehr Mäusen. Für die statistische Analyse wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukeys Mehrfachvergleichstest verwendet. NS, nicht signifikant; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. Die Werte werden als Mittelwerte1 SD dargestellt. e, f Lokalisierung von RSV nach Infektion in der Lunge (e) und im Nasenbereich (f), nachgewiesen durch Immunfluoreszenzassay. Maßstabsbalken: 50 µm. Gewebeschnitte wurden vorbereitet und mit Anti-RSV (Cy3 [rot]), DAPI (blau) und Phalloidin (iFluro647 [weiß]) gefärbt. Rote Flecken weisen auf eine RSV-Invasion hin. Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente und jede Gruppe bestand aus zwei oder drei Mäusen.

Als nächstes untersuchten wir die virale Infiltration in Lungen- und Nasengewebe mittels Fluoreszenzimmunfärbung von Proben, die von Mäusen NI mit PBS oder cCHP-[SHe-PspA] mit cdAMP oder Mäusen iPI mit SHe-PspA + IFA erhalten wurden (Abb. 3e, f ). 4 Tage nach der Virusbelastung zeigten NI-Mäuse mit cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP oder iPI mit SHe-PspA + IFA fast keine Virusinfiltration in der Lunge (Abb. 3e). In den Nasenkompartimenten zeigten Mäuse NI mit cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP eine geringere Virusinfiltration im Vergleich zu Mäusen iPI mit SHe-PspA + IFA (Abb. 3f).

Bisher zeigen unsere Ergebnisse, dass cCHP-[SHe-PspA] wirksam SHe-spezifische IgA-Antikörperreaktionen in Atemwegssekreten induziert (Abb. 2c, e). Als nächstes verwendeten wir einen Virusbindungsperlentest und eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung36, um zu untersuchen, ob die induzierten Antikörper41 direkt an RSV binden (ergänzende Abbildung 3). RSV A2 wurde an starke Anionenaustauschvirus-bindende Perlen konjugiert und mit Nasenspülproben von Mäusen (70 µL/Probe) inkubiert, die von Wildtyp (WT) BALB/c-Mäusen NI mit PBS, cCHP-[SHe-PspA] oder gesammelt wurden cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP. Darüber hinaus wurden Nasenspülproben von BALB/c-Mäusen mit Polymer-Ig-Rezeptor-Mangel (pIgR-/-) und cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP untersucht, um die Rolle von SHe-spezifischen mukosalen IgA-Antikörpern direkt zu untersuchen.

Wie erwartet enthielten Nasenspülungen der NI-WT-Mäuse signifikant höhere Mengen an SHe-spezifischen IgA- und IgG-Antikörpern im Vergleich zu denen von mit PBS immunisierten WT-Mäusen, die wie oben beschrieben sehr niedrige bis nicht nachweisbare Antikörpermengen aufwiesen (Abb. 2b – e). . Darüber hinaus wurde festgestellt, dass von NI-Mäusen gesammelte Antikörper direkt an die Oberfläche von RSV A2 binden (Abb. 4a, b). Die RSV-Bindungskapazitäten antigenspezifischer IgA- und IgG-Antikörper in Nasenspülungen von mit cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP immunisierten NI-Mäusen waren stärker als die von IgA und IgG von mit cCHP-[SHe-PspA] immunisierten NI-Mäusen. ohne cdAMP. Darüber hinaus war beim Vergleich der RSV-Bindungsfähigkeit zwischen den beiden Isotypen in Nasenspülungen aus verschiedenen NI-Gruppen die Bindungsfähigkeit des IgA-Antikörpers größer als die des IgG-Antikörpers (Abb. 4a, b). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass nasal induzierte Antigen-spezifische IgA-Antikörper in den Nasenkompartimenten eine entscheidende Rolle bei der Hemmung der Bindung von RSV an die Schleimhauthöhle der Atemwege spielen.

a, b Bindung an der RSV-Oberfläche durch Nasenspülung. SHe-spezifisches IgA (a) und IgG (b) wurde durch Bindungsperlen und fluoreszenzaktivierte Zellsortierungsanalyse nachgewiesen. RSV A2 wurde mit virusbindenden Perlen (RSV-Beads) konjugiert und mit Mäusenasenspülung inkubiert. Die Antikörperbindung wurde durch Messung der Intensität der Fluoreszenzmarkierung mittels Durchflusszytometrie bewertet, und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) jeder Gruppe wurde gemessen und als relative MFI bestimmt, wobei der Wert für RSV-Beads allein auf 1 gesetzt wurde. Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente, und jede Gruppe bestand aus fünf oder sechs Mäusen. c, d Nasenspül-SHe-spezifisches IgA (c) und Serum-SHe-spezifisches IgG (d) in pIgR WT (BALB/c) und pIgR−/− Mäusen. e Immunisierungsnaive BALB/c-Mäuse wurden intranasal mit RSV infiziert, das mit Nasenspüllösung von immunisierten Mäusen inkubiert wurde. Vier Tage später wurde der Virustiter der Nasenkompartimente mittels Plaque-Assay bestimmt. Die Daten sind repräsentativ für drei oder mehr unabhängige Experimente und jede Gruppe bestand aus vier oder mehr Mäusen (a–e). Für die statistische Analyse wurden eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Tukey-Mehrfachvergleichstest (a, b, e) und der zweiseitige Student-t-Test (c, d) verwendet. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. Die Werte werden als Mittelwerte ± 1 SD dargestellt.

Um die hemmende Rolle von Nasenhöhlen-IgA gegen die RSV-Bindung weiter zu bestätigen, wurden pIgR-/- BALB/c-Mäuse, denen die Fähigkeit fehlt, Antigen-spezifisches Schleimhaut-sekretorisches IgA42,43 zu produzieren, NI mit cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP behandelt Es wurde festgestellt, dass sie in Nasenspülungen im Vergleich zu denen von WT-Mäusen signifikant niedrigere bis nicht nachweisbare Mengen an SHe-spezifischem IgA aufwiesen (Abb. 4c). Im Gegensatz dazu wurden die gleichen Mengen an SHe-spezifischem Serum-IgG sowohl bei pIgR-/-- als auch bei WT-BALB/c-Mäusen beobachtet (Abb. 4d). Obwohl Nasenspülungen von NI-pIgR-/-Mäusen antigenspezifisches IgG enthielten, das an RSV binden konnte, war die Bindungsfähigkeit des Antikörpers genauso schwach wie die von IgG in Mäusen, denen PBS nasal verabreicht wurde (nicht immunisiert) (Abb. 4a, b). Diese Ergebnisse stützen die frühere Feststellung, dass Antigen-spezifisches IgA in den Nasenkompartimenten eine entscheidende Rolle bei der Verhinderung der RSV-Bindung an die Schleimhaut der oberen Atemwege spielt.

Um die entscheidende Rolle von IgA-Antikörpern in der Nasenhöhle für die Kontrolle einer RSV-Infektion der oberen Atemwege zu demonstrieren, wurde RSV mit denselben Nasenspülproben vorinkubiert, die von BALB/c-Mäusen erhalten wurden (z. B. WT und pIgR–/–). NI mit cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP. Als Kontrolle wurden Nasenspülungen der NI-Mäuse mit PBS verwendet. Das vorbehandelte RSV wurde dann zur intranasalen Belastung von immunisierungsnaiven BALB/c-Mäusen verwendet (ergänzende Abbildung 4). Vier Tage nach der intranasalen Belastung wurden die Virustiter in den Nasenkompartimenten mittels Immunplaque-Assay bestimmt. Verglichen mit den Nasenspülungen von NI-Mäusen mit PBS führten die Nasenspülungen von WT-BALB/c-Mäusen NI mit cCHP-[SHe-PspA] mit oder ohne cdAMP zu einer signifikant verringerten RSV-Invasion (Abb. 4e), wohingegen Nasenspülungen von pIgR −/− NI-Mäuse mit cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP, die antigenspezifische IgG-, aber nicht IgA-Antikörper enthielten, hatten keinen Einfluss auf die Virusinvasion (Abb. 4e). Die Viruslast bei den Mäusen, die eine Nasenspülung von WT BALB/c-Mäusen NI mit PBS erhielten (d. h. nicht immunisierte Mäuse), betrug 8,6 × 104 ± 2,6 × 104 PFU/g. Im Gegensatz dazu wurde eine Verringerung der Viruslast bei den Mäusen beobachtet, die Nasenspülungen von WT BALB/c-Mäusen NI mit cCHP-[SHe-PspA] (1,6 × 104 ± 8,9 × 103 PFU/g) und WT BALB/c-Mäusen NI erhielten mit cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP (8,6 × 103 ± 5,6 × 103 PFU/g). Es ist zu beachten, dass die Viruslast bei Mäusen, die Nasenspülungen von pIgR-/-Mäusen mit sekretorischem IgA-Mangel und cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP erhielten, erhöht war (9,3 × 104 ± 1,6 × 104 PFU/g). Diese Ergebnisse zeigen, dass nasale SHe-spezifische IgA-Antikörper eine wichtige Rolle bei der Hemmung einer RSV-Infektion an der Invasionsstelle, der Schleimhautoberfläche der Atemwege, spielen.

Zusätzlich zur Induktion einer schützenden Immunität der Atemwegsschleimhaut (Abb. 3) zeigen unsere Ergebnisse, dass cCHP-[SHe-PspA] antigenspezifische Serum-IgG-Antikörperreaktionen induziert, die denen entsprechen, die durch systemische Immunisierung induziert werden (Abb. 2b, d, 3a). , Sei). Aufbauend auf diesen Erkenntnissen verwendeten wir einen In-vitro-Plaque-Reduktionstest, um zu untersuchen, ob SHe-spezifisches Serum-IgG und Nasenspül-IgA von immunisierten Mäusen in der Lage sind, RSV direkt zu neutralisieren; Es wurde jedoch festgestellt, dass keiner der Antikörper eine direkte neutralisierende Wirkung gegen RSV ausübt (ergänzende Abbildung 5), wie bereits berichtet30,31. Als nächstes analysierten wir daher die zellulären und molekularen Mechanismen des systemischen Schutzes, der durch cCHP-[SHe-PspA] gegen RSV hervorgerufen wird.

Es wurde gezeigt, dass Antikörper, die an Antigene der Virusoberfläche binden, mit Leukozyten zusammenarbeiten können, um virusinfizierte Zellen über Fc-Rezeptoren abzutöten oder zu eliminieren, die auf der Oberfläche verschiedener Arten von Leukozyten exprimiert werden44,45. Um zu testen, ob der Fcγ-Rezeptor (FcγR) an der Prävention einer RSV-Infektion beteiligt ist, immunisierten wir WT- und FcγR-Null-Mäuse mit nicht adipösem Diabetiker (NOD) unter Verwendung des bereits beschriebenen Immunisierungsprotokolls (Tabelle 1 und Abb. 2a). Wir bestätigten, dass es keinen signifikanten Unterschied in den Serum-SHe-spezifischen IgG- oder Nasenspül-SHe-spezifischen IgA-Antikörperreaktionen zwischen den WT- und FcγR-Null-NOD-Mäusen gab (Abb. 5a, b). Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurden die Mäuse intratracheal mit 1 × 106 PFU RSV infiziert und 4 Tage nach der viralen Belastung wurden die Lungenviruslasten bestimmt. NI mit cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP reduzierte die RSV-Replikation in der Lunge von WT-NOD-Mäusen signifikant, jedoch nicht in FcγR-Null-NOD-Mäusen (Abb. 5c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass SHe-spezifische Serum-IgG-Antikörper, die durch NI mit cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP induziert werden, ebenso wie SHe-spezifisches IgG zur Fc-Rezeptor-vermittelten Immunantwort gegen Lungeninfektionen durch RSV (z. B. ADCC) beitragen Antikörper, die durch systemische Immunisierung induziert werden.

Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurden NOD-WT-Mäuse und NOD-FcγR-Null-Mäuse intratracheal mit dem RSV-A2-Stamm infiziert. a, b Serum-SHe-spezifisches IgG und Nasenspül-SHe-spezifisches IgA in NOD WT- und NOD FcγR-Null-Mäusen. Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente und jede Gruppe bestand aus sechs Mäusen. c Virusclearance aus der Lunge, bestimmt durch Nachweis von RSV-F- und -G-mRNA mittels Echtzeit-RT-PCR. Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente und jede Gruppe bestand aus sechs oder mehr Mäusen. Für die statistische Analyse wurden der zweiseitige Student-t-Test (a, b) und die einseitige Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukeys Mehrfachvergleichstest (c) verwendet. NS, nicht signifikant; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. Die Werte werden als Mittelwerte ± 1 SD dargestellt.

VED ist eine anerkannte Komplikation, die durch Impfungen gegen RSV11,12 hervorgerufen wird. Wir untersuchten daher, ob NI mit cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP VED induzierte, indem wir das zuvor beschriebene FI-RSV-VED-Modell mit geringfügigen Modifikationen verwendeten (ergänzende Abbildung 6). VED wurde am Tag 8 nach der intratrachealen RSV-Exposition bei NI-Mäusen mit PBS oder cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP durch Vergleich ihrer Th2-Typ-Immunantwort [d ] mit dem von FI-RSV VED-Modellmäusen. Die durch Echtzeit-RT-PCR bestimmte Zytokinreaktion vom Th2-Typ (d. h. die Expression von Interleukin-4, -5 und -13) war zwischen den NI-Mäusen mit PBS oder cCHP-[SHe-PspA]+ vergleichbar cdAMP (Abb. 6a). Im Gegensatz dazu wurde bei den FI-RSV-VED-Modellmäusen ein signifikanter Anstieg der Zytokinreaktion beobachtet (Abb. 6a). Die Infiltration von Eosinophilen in den BALF wurde auch mit der Siglec-F+- und CD11b+-Granulozytenfraktion untersucht, wie bereits berichtet49 (Abb. 6b), und bei den FI-RSV-VED-Modellmäusen wurde im Vergleich zu den Mäusen mit NI eine signifikant stärkere Eosinophileninfiltration beobachtet cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP (Abb. 6c). Darüber hinaus zeigte die histologische Untersuchung der Lunge eine deutliche Infiltration von Eosinophilen und einen Alveolarkollaps in der Lunge von FI-RSV-VED-Modellmäusen, aber keine entzündliche Zellinfiltration oder Gewebeschädigung bei den NI-Mäusen mit cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP (Abb. 6d). Diese Ergebnisse legen nahe, dass cCHP-[SHe-PspA] keine VED verursacht.

a mRNA-Expressionsniveaus der Th2-Typ-Zytokine Interleukin (IL)-4, -5 und -13. b Gating-Strategie für die durchflusszytometrische Analyse von Zellen in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF). Eosinophile wurden durch Vorwärts- und Seitwärtsstreuung als Siglec-F+CD11b+-Zellen in der Granulozytenpopulation separiert. c Eosinophilenpopulation unter Granulozyten bei BALF. Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente und jede Gruppe bestand aus fünf oder mehr Mäusen. Für die statistische Analyse wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukey-Mehrfachvergleichen verwendet (a, c). NS, nicht signifikant; ****p < 0,001. Die Werte werden als Mittelwerte ± 1 SD dargestellt. d Lungengewebeschnitte, die am Tag 8 nach der RSV-Infektion entnommen wurden, wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Maßstabsbalken: 50 µm. Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente und jede Gruppe bestand aus zwei oder drei Mäusen.

Um die Wirksamkeit von cCHP-[SHe-PspA] weiter zu bestätigen, untersuchten wir die Reaktionen bei einem experimentellen Modelltier zur Standard-RSV-Impfstoffwirksamkeit, der Baumwollratte (Sigmodon hispidus)50,51,52. Um zu beurteilen, ob cCHP-[SHe-PspA] eine schützende Immunität gegen RSV-Infektionen sowohl in den oberen als auch in den unteren Atemwegen induziert, wurden Baumwollratten NI mit PBS, SHe-PspA allein, cCHP-[SHe-PspA] oder cCHP-[SHe -PspA]+cdAMP. Andere Baumwollratten wurden mit SHe-PspA + IFA iPI (Tabelle 2 und Abb. 7a). Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurden SHe-spezifische Antikörpertiter im Serum und in der Nasenspülung der Baumwollratten bestimmt. Serum-SHe-spezifische IgG-Titer waren in den NI-Mäusen mit cCHP-[SHe-PspA] oder cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP oder iPI mit SHe-PspA+IFA erhöht, wohingegen in den Mäusen kein SHe-spezifisches IgG nachgewiesen wurde NI mit PBS oder SHe-PspA allein (Abb. 7b). SHe-spezifisches IgA wurde in der Nasenhöhle nur bei Baumwollratten NI mit cCHP-[SHe-PspA] oder cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP induziert (Abb. 7a, c). Diese Ergebnisse stimmten mit den in erhaltenen Daten überein Mäuse (Abb. 2b, c).

einen Impfplan. Weibliche Wildtyp-Baumwollratten (Sigmodon hispidus) wurden dreimal in wöchentlichen Abständen nasal immunisiert und erhielten dann zweimal in Abständen von zwei Wochen eine Auffrischungsimpfung. Andere Baumwollratten wurden alle 3 Wochen insgesamt dreimal intraperitoneal immunisiert. Die Kontrollgruppe (nicht immunisiert) erhielt intranasal verabreichtes PBS. b, c SHe-spezifische Antikörpertiter eine Woche nach der letzten Immunisierung im Serum und Nasenspülung. Die Daten sind repräsentativ für drei Experimente und jede Gruppe bestand aus fünf oder mehr Mäusen. ND, in unverdünnten Proben nicht nachweisbar. d, e Virusclearance aus Lunge und Nasenkompartimenten, bestimmt durch Immunplaque-Assay. Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente und jede Gruppe bestand aus vier oder mehr Mäusen (a–d). Für die statistische Analyse wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukeys Mehrfachvergleichstest verwendet. NS, nicht signifikant; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. Die Werte werden als Mittelwerte ± 1 SD dargestellt.

Als nächstes führten wir eine RSV-Exposition bei immunisierten Baumwollratten durch. Die Baumwollratten wurden intranasal mit dem RSV-A2-Stamm (3,0 × 105 PFU) gemäß einem zuvor festgelegten Protokoll zur Bewertung der Wirksamkeit des Impfstoffs gegen RSV-Infektionen in den Lungen- und Nasenkompartimenten infiziert40. Vier Tage nach der Virusbelastung wurde die Viruslast durch einen Immunplaque-Assay bestimmt (ergänzende Abbildung 2b). Bei den Baumwollratten NI mit cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP war die Viruslast in der Lunge signifikant niedriger als bei den Baumwollratten NI mit PBS oder cCHP-[SHe-PspA] (Abb. 7d). Die Viruslast bei den nicht immunisierten Baumwollratten betrug 9,6 × 104 ± 1,0 × 104 PFU/g. Bei Baumwollratten, die mit cCHP-[SHe-PspA] NI, cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP NI oder [SHe-PspA]+IFA iPI immunisiert wurden, wurde eine Verringerung der Viruslast festgestellt (3,5 × 104 ± 1,4 × 104, 8,0 × 103 ± 3,6 × 103 bzw. 1,9 × 104 ± 9,2 × 103 PFU/g). Darüber hinaus zeigten iPI von Baumwollratten mit SHe-PspA+IFA auch eine geringe Viruslast in der Lunge (Abb. 7d). In den Nasenkompartimenten führte NI mit cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP zu einer deutlich verringerten Viruslast im Vergleich zu denen nach NI mit PBS oder iPI mit SHe-PspA+IFA (Abb. 7e). Die Viruslast bei den nicht immunisierten Baumwollratten betrug 4,0 × 104 ± 1,2 × 104 PFU/g. Bei Baumwollratten, die mit cCHP-[SHe-PspA] NI, cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP NI oder [SHe-PspA]+IFA iPI immunisiert wurden, wurde eine Verringerung der Viruslast festgestellt (2,1 × 104 ± 1,0 × 104, 6,7 × 103 ± 1,1 × 104 bzw. 2,7 × 104 ± 6,5 × 103 PFU/g). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse weiter darauf hin, dass cCHP-[SHe-PspA] ein attraktiver Impfstoffkandidat für die Prävention einer RSV-Infektion ist.

RSV zeichnet sich durch seine drei Transmembranoberflächenproteine ​​aus: die Proteine ​​F, G und SH. Die meisten bisher entwickelten Anti-RSV-Impfstoffe verwenden Oberflächenprotein F als Antigen;53,54 und der Rezeptor wurde kürzlich identifiziert55. Darüber hinaus haben F-Protein-basierte Impfstoffe für die Immunität von Müttern20 und älteren Erwachsenen21,22 in klinischen Phase-III-Studien vielversprechende Ergebnisse gezeigt. Diese Impfstoffe wurden jedoch durch Injektion verabreicht. Obwohl das Oberflächenprotein F im gesamten Spektrum der RSV-Stämme hoch konserviert ist und für die Lebensfähigkeit des Virus von entscheidender Bedeutung ist14, kann das RSV-Virus darüber hinaus eine Konformationsänderung am F-Protein vornehmen, um eine Antikörperneutralisierung zu vermeiden28,56,57,58,59. Mittlerweile ist Oberflächenprotein G das variabelste der RSV-Oberflächenproteine60 und induziert Th2-abhängige aberrante Immunantworten, die über wachstumsstillstandsspezifische 6-Signale FI-RSV-VED verursachen40. Daher müssen noch einige Hindernisse überwunden werden, bevor ein wirksamer Nasenimpfstoff auf Basis dieser beiden Antigene entwickelt werden kann. In dieser Studie haben wir uns auf die Entwicklung nasaler Impfstoffe konzentriert, die die Ektodomäne des SH-Proteins (SHe) als Impfstoffantigen30,32 verwenden, das über unser cCHP-Nanogel-Abgabesystem23,24,25,26,35,36,37,38,61 eingesetzt wird .

SH-Protein ist ein integrales Membranprotein vom Typ II mit 64 (RSV/A) oder 65 (RSV/B) Aminosäuren62. Obwohl die Funktion des SH-Proteins noch unklar ist63, könnte es eine Rolle bei der Virusfusion64,65 oder bei der Veränderung der Membranpermeabilität66 spielen. Dennoch ist RSV ohne SH-Gen (RSVΔSH) lebensfähig und kann sich genauso gut replizieren wie WT-RSV67,68, was darauf hinweist, dass das SH-Protein für den Viruseintritt in Wirtszellen nicht erforderlich ist65. Vor diesem Hintergrund geht man davon aus, dass das SH-Protein im Gegensatz zu den beiden anderen wichtigen Oberflächenproteinen F und G29 keine hohen Mengen an neutralisierenden Antikörpern hervorruft oder bei einer Infektion zur Wirtsabwehr beiträgt. Ebenso besteht SHe, die Ektodomäne des SH-Proteins, aus 23 (RSV/A) oder 24 (RSV/B) Aminosäuren und scheint eine schwache Immunogenität zu haben31,33,34. Tatsächlich wurde berichtet, dass die SHe-spezifischen IgG-Spiegel in Rekonvaleszenzseren von RSV-infizierten BALB/c-Mäusen und Baumwollratten sowie in menschlichen Referenzseren sehr niedrig sind30. Aufgrund seiner geringen Immunogenität31,33,34 wurde SHe im Vergleich zu den Proteinen F und G nicht für die Entwicklung als Impfstoff priorisiert. Um diesem Trend entgegenzuwirken, haben wir ein neues chimäres Antigen entwickelt, bei dem drei SHe nacheinander an einen Träger gebunden sind Protein (PspA) (Abb. 1a–c) und dann in ein wirksames nasales Verabreichungsvehikel eingebaut, unser kationisches Nanogel cCHP23,24,25,26,35,36,37,38,61 (Abb. 1c).

Der nasale Impfweg ist wahrscheinlich die wirksamste Strategie, um eine schützende Immunität gegen Atemwegsinfektionen wie RSV hervorzurufen. Tatsächlich kann eine nasale Impfung sowohl antigenspezifische mukosale als auch systemische Immunantworten auslösen69, wohingegen herkömmliche Injektionsimpfstoffe bei der Induktion einer mukosalen Immunität weniger wirksam sind, obwohl sie wirksame antigenspezifische Immunantworten im systemischen Kompartiment auslösen70. Darüber hinaus haben nasale Impfstoffe die Fähigkeit, hohe Mengen an neutralisierenden IgA-Antikörpern in den Atemwegssekreten zu induzieren, was direkt mit einer schützenden Immunantwort gegen RSV71,72,73 verbunden ist. Nasale Impfstoffe induzieren eine Schleimhautimmunität, indem sie das Impfantigen an die antigenentnehmenden klassischen und respiratorischen M-Zellen abgeben, die sich im einschichtigen Epithel der Nasenhöhle befinden, einschließlich des nasopharyngealassoziierten Lymphgewebes und der Nasenhöhle74. Allerdings ist ein Impfstoff, der nur das Antigen enthält, oft nur schwach immunogen. Um dieses Problem anzugehen, haben wir ein cCHP-Nanogel entwickelt, das für die Abgabe von Antigenen an die Nasenschleimhaut38 verwendet werden soll, und wir haben seine Wirksamkeit und Sicherheit sowohl in Maus23,26 als auch in nichtmenschlichen Primatenmodellen36,37,75 gegen Streptococcus pneumoniae nachgewiesen Infektion. Wir haben daher dieses cCHP-Nanogel-Abgabesystem verwendet, um einen RSV-Nasenimpfstoff zu entwickeln, der unser chimäres Proteinantigen enthält.

Hier stellten wir fest, dass unser neu entwickelter cCHP-basierter SHe-Nasenimpfstoff bei Mäusen SHe-spezifische Schleimhaut-IgA- und systemische IgG-Antikörperreaktionen induzierte (Abb. 2b – e). Darüber hinaus induzierte die Zugabe von cdAMP als nasales Adjuvans signifikant höhere Antikörpertiter als diejenigen, die ohne cdAMP hervorgerufen wurden (Abb. 2b – e). Die Immunisierung mit cCHP-[SHe-PspA] plus Adjuvans führte zu vergleichbaren SHe-spezifischen IgG-Titern, die bei Mäusen beobachtet wurden, die systemisch mit SHe-PspA plus IFA immunisiert wurden (Abb. 2b, d). Hierbei ist zu beachten, dass mukosale SHe-spezifische IgA-Antikörperreaktionen nur bei NI-Mäusen induziert wurden (Abb. 2c, e). Um die funktionellen Eigenschaften der SHe-spezifischen Antikörper zu beurteilen, wurden immunisierte Mäuse einer Schleimhautprovokation mit lebendem RSV ausgesetzt. Unser cCHP-basierter SHe-Nasenimpfstoff reduzierte die Virusreplikation in den Nasenkompartimenten und der Lunge (Abb. 3a–f) und zeigte, dass der Impfstoff zur Bekämpfung von RSV-Infektionen sowohl in den oberen als auch in den unteren Atemwegen wirksam ist (Abb. 3a–f). ). Die Hemmung der RSV-Replikation in der Lunge war bei den immunisierten Mäusen unabhängig von den Immunisierungswegen ähnlich (Abb. 3a, b, e). In den Nasenkompartimenten zeigten NI-Mäuse mit cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP im Vergleich zu den anderen Gruppen immunisierter Mäuse ein signifikant niedriges Maß an RSV-Replikation (Abb. 3c, d). Diese Ergebnisse wurden durch immunhistochemische Analysen an Schnitten der Lungen- und Nasenschleimhaut gestützt (Abb. 3e, f). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Induktion von antigenspezifischen Schleimhaut-IgA- und Serum-IgG-Antikörpern eine zentrale Rolle bei der Hemmung der RSV-Replikation in den oberen bzw. unteren Atemwegen spielt.

Frühere Berichte haben gezeigt, dass SHe-spezifische IgG-Antikörper keine direkte neutralisierende Wirkung gegen RSV30,31 zeigen. Tatsächlich haben wir bestätigt, dass SHe-spezifische Serum-IgG- und Nasenspül-IgA-Antikörper, die durch unseren Nasenimpfstoff induziert wurden, keine neutralisierende Wirkung gegen RSV hatten (ergänzende Abbildung 5). Wir haben daher untersucht, wie die in den Nasenkompartimenten induzierten SHe-spezifischen IgA-Antikörper RSV in den oberen Atemwegen eliminieren, wenn sie keine direkte neutralisierende Funktion gegen RSV besitzen. Wir untersuchten die Bindungskapazitäten von SHe-spezifischen IgA- und IgG-Antikörpern gegen RSV in Nasenspülungen, die von immunisierten Mäusen gesammelt wurden (Abb. 4a, b). SHe-spezifische IgA- und IgG-Antikörper aus Nasenspülungen von Mäusen NI mit cCHP-[SHe-PspA], beide gebunden an RSV (Abb. 4a, b); Allerdings war die Intensität der Bindung durch IgG geringer als die von IgA. Darüber hinaus reichert sich IgG, das auf der Schleimhaut der oberen Atemwege nachgewiesen wird, dort durch passive Diffusion aus dem Serum76 an, während IgA kontinuierlich von Plasmazellen produziert wird, die sich im Schleimhautkompartiment befinden77,78. Obwohl es möglicherweise eine gewisse zusätzliche Immunität gegen SHe-spezifisches IgG im Serum in den Nasenspülungen gibt, wurde die hauptsächliche schützende Immunität durch SHe-spezifische Schleimhaut-IgA-Antikörper bereitgestellt.

Um die Rolle von SHe-spezifischen nasalen IgA-Antikörpern weiter zu demonstrieren, wurde ein intranasaler Challenge-Test mit vorinkubiertem RSV mit oder ohne Nasenspülungen von Mäusen durchgeführt, die mit unserem cCHP-basierten SHe-Impfstoff nasal immunisiert wurden. Nasenspülungen von nasal immunisierten pIgR-/-Mäusen, die nicht in der Lage sind, mukosale SHe-spezifische mukosale IgA-Antikörper abzusondern, wurden zur Vorinkubation von RSV verwendet. Mit Nasenspülungen der immunisierten pIgR-/−-Mäuse vorbehandeltes RSV verursachte eine Infektion, wohingegen mit Nasenspülungen von nasal immunisierten WT-Mäusen vorbehandeltes RSV keine Infektion verursachte (Abb. 4e). Dies deutet darauf hin, dass durch den nasalen Impfstoff induzierte SHe-spezifische IgA-Antikörper als aktiver Immunabwehrmechanismus in den oberen Atemwegen wirken. Tatsächlich könnten große Mengen der SHe-spezifischen IgA-Antikörper in den Nasenspülungen RSV stark binden (Abb. 4a, c), was zu einer signifikanten Verringerung der Virusreplikation führt (Abb. 4e). Basierend auf diesen Erkenntnissen scheint es, dass SHe-spezifische IgA-Antikörper keine klassische neutralisierende Wirkung der Hemmung der RSV-Replikation aufweisen (ergänzende Abbildung 5), obwohl sie an RSV binden können, um den Zugang des Virus zu Epithelzellen der oberen Atemwegsschleimhaut zu verhindern (Abb. 4a, e).

Das SH-Protein fördert eine schützende Immunantwort in Tiermodellen einer RSV-Infektion über einen Fc-Rezeptor-vermittelten ADCC-Mechanismus30,32. Daher ist es wichtig zu klären, ob unsere durch cCHP-basierten Impfstoff induzierten SHe-spezifischen IgG-Antikörper die gleiche Fc-Rezeptor-vermittelte schützende Immunität aufweisen. Wir fanden heraus, dass FcγR-Null-Mäuse auf dem NOD-Hintergrund, denen nasales cCHP-[SHe-PspA] verabreicht wurde, trotz des Vorhandenseins hoher Mengen an SHe-spezifischen Serum-IgG-Antikörpern keinen Schutz gegen RSV-Exposition zeigten (Abb. 5a, c). Im Gegensatz dazu zeigten WT-NOD-Mäuse NI mit cCHP-[SHe-PspA] Schutz vor intratrachealer RSV-Infektion und produzierten hohe Mengen an SHe-spezifischen Serum-IgG-Antikörpern (Abb. 5a, c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Fc-Rezeptor-vermittelte Zell-Zell-Interaktionen (z. B. ADCC)79 höchstwahrscheinlich der Schutzmechanismus von SHe-spezifischen systemischen IgG-Antikörpern sind, die durch unseren cCHP-basierten Nasenimpfstoff induziert werden. Diese Ansicht wird durch Berichte gestützt, dass einige Impfstoffe gegen Influenzaviren80 und Infektionen mit dem humanen Immundefizienzvirus81 ADCC als Schutzmechanismus gegen Virusinfektionen nutzen; Diese Berichte zeigen, dass diese Impfstoffe eine Virussuppression induzieren, ohne dass neutralisierende Antikörper induziert werden80,81. Obwohl unsere Ergebnisse zeigen, dass die durch unseren Nasenimpfstoff induzierten SHe-spezifischen Antikörper keine virusneutralisierende Wirkung haben, ist es dennoch möglich, dass unser Impfstoff die RSV-Infektion im klinischen Umfeld kontrollieren kann, da er SHe-spezifische IgG-Antikörper induzieren kann und Fc-Rezeptor-vermittelte Immunantworten (z. B. ADCC) für systemischen Schutz sowie SHe-spezifische IgA-Antikörper in den Nasenkompartimenten, die stark an RSV binden und so die Virusinvasion an der Schleimhautoberfläche blockieren. Eine kürzlich durchgeführte nichtmenschliche Primatenstudie mit Nasenimpfstoffen mit F-Protein-verwandten Antigenen hat ebenfalls ähnliche Ergebnisse wie unsere SHe-basierten Nasenimpfergebnisse (Abb. 4, 5) bei der Kontrolle von Infektionen der oberen und unteren Atemwege durch virusspezifische IgA-Antikörper gezeigt bzw. Fc-vermittelte Effektormechanismen82. Darüber hinaus lieferte unsere Studie Hinweise darauf, dass ein auf cCHP-[SHe-PspA] basierender Nasenimpfstoff in der Lage ist, antigenspezifische T-Zellen zu induzieren, die Granzym B oder IFN-γ produzieren (ergänzende Abbildung 1), was auf einen möglichen Beitrag zur zellvermittelten Immunität hindeutet. In einer separaten Studie zielen unsere Bemühungen derzeit darauf ab, die RSV-spezifische T-Zell-Immunität detaillierter zu charakterisieren, einschließlich der Beiträge von residenten und zirkulierenden SHe-spezifischen T-Effektor- und Gedächtniszellen.

Sicherheit ist ein weiteres wichtiges Anliegen bei der Impfstoffentwicklung, insbesondere bei RSV-Impfstoffen, da es in der Vergangenheit Fälle von schweren, schädlichen Nebenwirkungen und FI-RSV-VED durch RSV-Impfstoffe gegeben hat11,12. Wir verwendeten das FI-RSV-VED-Modell40, um die Sicherheit unseres cCHP-basierten SHe-Nasenimpfstoffs zu bewerten, indem wir untersuchten, ob schwere Th2-vermittelte allergische Reaktionen durch eine RSV-Infektion bei NI-Mäusen hervorgerufen wurden. Bei den nasal immunisierten Mäusen wurden keine offensichtlichen klinischen Symptome vom allergischen Typ oder abweichende Reaktionen vom Typ Th2 beobachtet, die an FI-RSV VED erinnern (Abb. 6a – d). Diese Ergebnisse liefern unterstützende Beweise für die Sicherheit unseres cCHP-basierten SHe-PspA-Nasenimpfstoffs.

Das RSV-Baumwollrattenmodell gilt als ein am Menschen anwendbares System für Impfstofftests, da das Modell nach einer RSV-Infektion eine ähnliche Atemwegspathologie wie beim Menschen zeigt50,51,52. Tatsächlich ist der translationale Wert des Baumwollrattensystems gut belegt50 und es hat sich zu einem anerkannten Modell für die Untersuchung von RSV-Infektionen83 entwickelt. Mit Baumwollratten konnten wir die Ergebnisse unserer Mausexperimente reproduzieren (Abb. 7a–e). Baumwollratten NI mit cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP zeigten erhöhte Spiegel an SHe-spezifischen Serum-IgG- und Schleimhaut-IgA-Antikörpern (Abb. 7b, c). In einer intranasalen RSV-Challenge-Studie zeigten Baumwollratten NI mit cCHP-[SHe-PspA] + cdAMP schützende Wirkungen sowohl im oberen als auch im unteren Atemtrakt (Abb. 7d, e), wobei die RSV-Replikation im oberen Atemtrakt im Vergleich signifikant unterdrückt wurde damit bei systemisch immunisierten Baumwollratten (Abb. 7e). Mithilfe des Baumwollrattenmodells konnten wir somit zusätzliche unterstützende Beweise für die Wirksamkeit unseres cCHP-basierten SHe-Nasenimpfstoffs gegen RSV-Infektionen liefern.

Die aktuelle Studie hat eine solide Grundlage für den Machbarkeitsnachweis für die Induktion einer schützenden Schleimhaut- und systemischen Immunität gegen RSV durch nasale Immunisierung mit der neuen Impfstoffkandidatenformulierung von cCHP-[SHe-PspA] geliefert. Somit hat die Studie gezeigt, dass ein schwaches, aber sicheres Antigen des Impfstoffkandidaten, SHe, für die Entwicklung eines Impfstoffs verwendet werden könnte, der ein nasales Impfstoffabgabesystem, cCHP, und/oder den Adjuvanskandidaten cdAMP nutzt, indem Maus- und Baumwollrattenmodelle verwendet werden. Wir sind uns jedoch darüber im Klaren, dass die Häufigkeit der Impfungen, die wir in dieser Studie berücksichtigt haben, möglicherweise zu hoch ist, um sie für eine zukünftige klinische Anwendung in Betracht zu ziehen. In unserer nächsten präklinischen Studie werden wir diesen Impfplan optimieren, um ihn für die klinische Praxis besser geeignet zu machen.

Zusammenfassend haben wir hier gezeigt, dass unser cCHP-basierter SHe-Nasenimpfstoff eine RSV-spezifische schützende Immunität sowohl im Schleimhaut- als auch im Systembereich von Mäusen und Baumwollratten bietet, ohne VED zu verursachen. Daher ist diese Formulierung ein vielversprechender Kandidat für die Entwicklung als Impfstoff zur Vorbeugung einer RSV-Infektion. Weitere Studien, einschließlich klinischer Tests, sind erforderlich.

Der RSV-Stamm A2 wurde von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) erhalten (ATCC-Nummer VR-1540TM, Chargennummer: 70021273). RSV wurde in kultivierten HEp-2-Zellen (ATCC) vermehrt, gesammelt und als Vorrat bei –80 °C gelagert. Die Virustiter der infektiösen Einheit in den RSV-Beständen wurden in HEp-2-Zellen durch Immunplaque-Assay vierfach quantifiziert.

BALB/c-Mäuse wurden von Japan SLC (Shizuoka, Japan) gekauft. pIgR-/-Mäuse auf dem BALB/c-Hintergrund wurden durch Passagierung in unserem Labor erhalten42,43, NOD-Mäuse wurden von CLEA Japan (Tokio, Japan) gekauft. FcγR-Null-Mäuse (sowohl FcR-gemeinsame γ-Kette [FcRγ] als auch FcγRIIB-defizient) auf dem NOD-Hintergrund46 wurden von RIKEN BRC (Tsukuba, Japan) erhalten. Alle Mäuse waren weiblich und zu Beginn der Studie 7–8 Wochen alt. Weibliche Baumwollratten (Alter: 6 Wochen) wurden von ENVIGO (Indianapolis, IN, USA) über Japan SLC (Shizuoka, Japan) gekauft. Alle Nagetiere wurden mit Ad-libitum-Futter und Wasser in einem Standard-Hell/Dunkel-Zyklus von 12 Stunden/12 Stunden gehalten.

Wir haben ein SHe-PspA-Antigen entwickelt, bei dem Pneumokokken-Oberflächenprotein A (PspA) als Trägerprotein zur Verbesserung der Immunogenität von SHe84 verwendet wurde. Das SHe-PspA-Impfstoffantigen umfasste drei Wiederholungen des SHe-Peptids des RSV-A-Stammes (NKLSEYNVFHNKTFELPRARVNT) am C-Terminus und die PspA-Sequenz des S. pneumoniae-Stamms Rx1 (pUAB055; Aminosäuren 1–302) (GenBank-Zugangsnummer M74122). am N-Terminus. Die einzelnen SHe-Sequenzen wurden durch einen flexiblen GGGGS-Linker voneinander getrennt. Das SHe-PspA-Gen wurde von Takara Bio Inc. (Otsu, Japan) synthetisiert und nach der Verdauung mit den Restriktionsenzymen Nco I und Xho I (Takara Bio Inc.) in den pET-20b (+)-Vektor (Novagen, Japan) eingefügt. Inc., Madison, WI) einschließlich eines C-terminalen His-Tags. Rosetta2(DE3) pLysS-kompetente Zellen (Novagen, Inc.) wurden mit dem SHe-PspA-kodierenden Plasmid gemäß dem Protokoll des Herstellers transformiert. Der resultierende Transformant wurde in Lysogeniebrühe mit 100 µg/ml Ampicillin inokuliert und unter Schütteln bei 37 °C inkubiert, bis der OD600-Wert 0,5–0,8 betrug. Nach 3,5-stündiger Induktion mit 0,4 mM Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) wurden die Zellen durch 15-minütige Zentrifugation bei 4620 × g bei 4 ° C geerntet und anschließend kultiviert extrahiert als lösliches Protein in PBS (pH 7,4), das 40 mM Imidazol und Proteaseinhibitor enthält (cOmplete; Roche Diagnostics KK, Tokio, Japan). Das gewünschte Protein wurde dann durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat (80 % Sättigung) und anschließende Dialyse gegen einen Natriumphosphatpuffer mit 40 mM Imidazol unter Verwendung eines nahtlosen Zelluloseschlauchs (Sanko Junyaku Co., Ltd., Tokio, Japan) gereinigt. Das Protein wurde dann mittels Nickelaffinitätschromatographie (GE Healthcare Bio-Sciences KK, Tokio, Japan) gereinigt, gefolgt von Gelfiltration auf einer Sephadex G-100-Säule (GE Healthcare Bio-Sciences KK) (2,5 × 100 cm) unter Verwendung von PBS . Die Reinheit des SHe-PspA-Impfstoffs betrug laut SDS-PAGE mehr als 95 % (Abb. 1a). Nach der SDS-PAGE mit CBB-Färbung wurde die SHe-PspA-Bande mit einem Molekulargewicht von 50–55 kDa aus dem Gel ausgeschnitten und über Nacht bei 37 °C mit 0,2 µg Trypsin (Sequenzqualität, Promega, Madison, WI) verdaut. , entsalzt und dann auf ein Volumen von 20 ml konzentriert. Die Proben wurden dann in ein direktes Nanoflow-Flüssigkeitschromatographiesystem (Dina; KYA Technologies) injiziert und in ein lineares Ionenfallen-Orbitrap-Massenspektrometer (LTQ Orbitrap; Thermo Fischer Scientific, Suwanee, GA) gesprüht (Abb. 1b). Die Analyse der Daten mithilfe des Mascot-Suchservers bestätigte die vollständigen Aminosäuresequenzen des in E. coli exprimierten SHe-PspA.

Das cCHP-Nanogel wurde wie zuvor beschrieben85 synthetisiert. Zur Formulierung des SHe-PspA-Impfstoffs haben wir das cCHP-Nanogel37 in einem Molekülverhältnis von 1:1 mit SHe-PspA gemischt und anschließend eine Stunde lang bei 40 °C inkubiert, um das SHe-PspA in die kationisch geladenen Nanopartikel einzubauen (Abb. 1c). Durch einen Limulus-Test (Fujifilm Wako Chemicals, Tokio, Japan) wurde bestätigt, dass die Lipopolysaccharid-Kontamination des cCHP-Nanogels oder des rekombinanten SHe-PspA-Proteins weniger als 10 Endotoxineinheiten/mg Protein betrug.

Mäuse wurden drei aufeinanderfolgende Wochen lang einmal wöchentlich mit PBS, SHe-PspA allein, cCHP-[SHe-PspA] oder cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP (cdAMP, 10 µg; Yamasa Corporation, Chiba, Japan) behandelt dann noch zweimal im Abstand von zwei Wochen geboostet (10 μg SHe-PspA-Protein pro Immunisierung). Andere Mäuse erhielten iPI mit SHe-PspA plus unvollständigem Freund-Adjuvans (IFA, 100 µL; BD Difco, Franklin Lakes, NJ, USA) oder SHe-PspA allein dreimal alle 3 Wochen (Tabelle 1 und Abb. 2a). Serum, Nasenspülung und BALF wurden eine Woche nach der letzten Immunisierung gesammelt. Blutproben wurden aus der Unterkiefervene von Mäusen entnommen86. Zum Sammeln der Nasenspülproben wurden insgesamt 100 μl steriles PBS durch Pipettieren mit 4 μl-Aliquots PBS durch die vordere Nasenhöhle gespült. BALF wurde durch Einträufeln von 1 ml sterilem PBS durch eine stumpfe Nadel in der Luftröhre geerntet.

Zur Immunisierung wurden Mäuse intraperitoneal mit einer Mischung aus Medetomidin, Midazolam und Butorphanol (MMB)87,88 anästhesiert. Kurz gesagt wurden Medetomidinhydrochlorid (Domitor®, ZENOAQ, Koriyama, Japan), Midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma Inc., Tokio, Japan) und Butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika Pharma Co., Ltd., Tokio, Japan) verwendet als MMB-Anästhetika. Medetomidin, Midazolam und Butorphanol wurden gemischt und mit Kochsalzlösung (Otsuka Normal Saline®, Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc., Tokushima, Japan) auf Konzentrationen von 0,06, 0,8 bzw. 1,0 mg/ml verdünnt. Anschließend wurde MMB mit einem Dosierungsvolumen von 5 ml/kg verabreicht.

Baumwollratten wurden drei aufeinanderfolgende Wochen lang einmal pro Woche mit PBS, cCHP-[SHe-PspA] oder cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP (5 µg; Ajinomoto, Tokio, Japan) NI behandelt und dann noch zwei weitere Male bei 2 Wochen geboostet -wöchige Intervalle (100 µg SHe-PspA-Protein pro Immunisierung). Andere Gruppen von Baumwollratten wurden dreimal alle 3 Wochen mit SHe-PspA plus IFA (200 µL; BD Difco) iPI behandelt (Tabelle 2 und Abb. 7a). Serum und Nasenspüllösung wurden eine Woche nach der letzten Immunisierung gesammelt. Blutproben wurden aus der seitlichen Schwanzvene von Baumwollratten entnommen. Zum Sammeln der Nasenspülproben wurden insgesamt 100 μl steriles PBS durch Pipettieren mit 10 μl-Aliquots PBS durch die vordere Nasenhöhle gespült. Zur Immunisierung wurden Baumwollratten mit einer Konzentration von 3–4 % Isofluran (Muromachi Kikai Co., Ltd.) eingeschläfert.

Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurden Mäuse intratracheal mit 1 × 106 PFU RSV, suspendiert in 50 µL PBS, provoziert, um die Wirksamkeit des Impfstoffs in den unteren Atemwegen zu bewerten, und andere Mäuse wurden intranasal mit 1 × 105 PFU RSV, suspendiert in 12 µL, provoziert von PBS, um die Wirksamkeit des Impfstoffs in den oberen Atemwegen unter Anästhesie mit MMB wie oben beschrieben zu bewerten. Vier Tage nach der Infektion wurden die Mäuse eingeschläfert und die Lungen- und Nasenkompartimente gesammelt und auf ihre Viruslast untersucht (ergänzende Abbildung 2a).

Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurden Nasenspülungen von immunisierten Mäusen gesammelt. Proben der Nasenspülung (7 µL/Probe) wurden in serumfreiem Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) verdünnt und dann mit 1,0 × 105 PFU RSV 30 Minuten lang bei 37 °C in einem endgültigen nasalen Belastungsvolumen von 12 µL inkubiert pro Maus. Nach der Inkubation wurde RSV naiven BALB/c-Mäusen intranasal verabreicht, wie oben beschrieben (ergänzende Abbildung 4).

Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurden Baumwollratten intranasal mit 3 × 105 PFU RSV, suspendiert in 100 µL PBS, unter Narkose mit 3–4 % Isoflurankonzentration, wie oben beschrieben, belastet, um die Wirksamkeit des Impfstoffs in den oberen und unteren Atemwegen zu bewerten. Vier Tage nach der Infektion wurden die Baumwollratten eingeschläfert und die Lungen- und Nasenkompartimente gesammelt und auf ihre Viruslast untersucht (ergänzende Abbildung 2b).

Antikörpertiter von Anti-SHe-IgG oder -IgA von immunisierten Mäusen und Baumwollratten wurden durch einen enzymgebundenen Immunosorbens-Assay23 bestimmt. Serum-, Nasenspül- und BALF-Proben wurden in zweifachen Verdünnungsreihen hergestellt und in eine 96-Mikrowellplatte (NUNC MAXISORP IMMUNO; Thermo Fisher Scientific) geladen, die mit 1 μg/ml rekombinantem SHe, konjugiert mit Rinderserumalbumin (BSA), beschichtet war ). Die Synthese der SHe-Peptide und BSA-SHe für diesen Test wurde in unserem Auftrag von Eurofins Genomics KK (Tokio, Japan) durchgeführt. SHe-Peptide wurden mithilfe der Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl (Fmoc)-Festphasenpeptidsynthese89 synthetisiert und anschließend chemisch mit BSA konjugiert. Die Zielpeptidsequenz war NH2-C+NKLSEYNVFHNKTFELPRARVNT-COOH. Meerrettichperoxidase-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:4000; Nr. 1030-05, SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA), Ziegen-Anti-Maus-IgA (1:4000; Nr. 1040-05, SouthernBiotech), Ziegen-Anti-Ratte Als Sekundärantikörper wurden IgG (1:4000; Nr. 3030-05, SouthernBiotech) und Ziegen-Anti-Ratten-IgA (1:40.000; Nr. 97185, Abcam, Cambridge, UK) verwendet. Die Reaktionen wurden mithilfe des TMB Microwell Peroxidase Substrate System (XPL, Gaithersburg, MD, USA) sichtbar gemacht. Der Endpunkttiter wurde als reziproker log2 der letzten Verdünnung ausgedrückt, die eine OD450 ergab, die um 0,1 Einheiten höher war als die der Negativkontrolle.

Für den Immunplaque-Assay wurden die gesamten Lungen- und Nasenkompartimente homogenisiert und serielle Verdünnungen des Überstands in einer 24-Well-Platte (Corning, NY, USA) mit HEp-2-Zellmonoschichten in DMEM inkubiert und mit 3,0 % Methylcellulose überschichtet zuvor beschrieben40,90. Nach 3 Tagen wurden virale Plaques mithilfe eines polyklonalen Ziegen-Anti-RSV-Antikörpers (1:200; #AB1128, Millipore, Billerica, MA, USA) und eines mit Meerrettichperoxidase konjugierten Kaninchen-Anti-Ziegen-IgG-Sekundärantikörpers (H+L) sichtbar gemacht. 1:100; #61-1620, Thermo Fisher Scientific)40. Die endgültig sichtbaren Plaques wurden gezählt und die Anzahl der Plaques pro Gramm Gewebe (PFU/g-Gewebe) berechnet.

Die Virusneutralisierungsaktivität von Mäuseserum und Nasenspülung wurde durch einen Plaque-Reduktionstest unter Verwendung von Palivizumab (Synagis; AbbVie Inc. North Chicago, IL, USA), einem monoklonalen Anti-RSV-Antikörper, als Positivkontrolle getestet. Serum oder Nasenspüllösung von immunisierten Mäusen wurden in serumfreiem DMEM verdünnt und mit etwa 400 PFU bzw. 25 PFU RSV 30 Minuten lang bei 37 °C in einem Endvolumen von 1,5 ml inkubiert. Diese Proben wurden dann verwendet, um eine konfluente Zellschicht aus HEp-2-Zellen zu infizieren, die in einer 24-Well-Platte (Corning) in DMEM gezüchtet und mit 3,0 % Methylcellulose überschichtet wurde40. Am Tag 3 wurde der Plaque-Reduktionstest mit dem Anti-RSV-Antikörper wie oben beschrieben durchgeführt.

Lungen- und Nasenhöhlenproben für die konfokale Mikroskopie wurden wie zuvor beschrieben91 vorbereitet. Kurz gesagt, die Proben wurden in 4 % (Gew./Vol.) Paraformaldehyd in PBS über Nacht bei 4 °C unter Schütteln fixiert, gefolgt von einem Einweichen in 20 % (Gew./Vol.) Saccharose in PBS über Nacht bei 4 °C unter Schütteln. Die Proben wurden dann in Super Cryoembedding Medium (Leica Microsystems KK, Wetzlar, Deutschland) eingebettet. Für die Immunfluoreszenzfärbung wurden 10 μm dicke gefrorene Schnitte unter Verwendung eines CryoJane Tape-Transfer-Systems (Instrumedics, St. Louis, MO, USA) hergestellt und die Schnitte an der Luft trocknen lassen. Das RSV in den Schnitten wurde mithilfe eines polyklonalen Ziegen-Anti-RSV-Antikörpers (1:480; #AB1128, Millipore, Billerica, MA, USA) und eines Esel-Anti-Ziegen-IgG (H+L) (1:400; #) nachgewiesen. 705-166-147, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA). Nasenhöhlenschnitte wurden weiter mit Phalloidin-iFluro647-Reagenz (1:1000; #176759, Abcam) auf Aktinfilamente gefärbt. Nach dem Waschen wurden die Proben in ProLong Glass Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific) mit DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) montiert und mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop DM-IRE2 (Leica Microsystems KK) analysiert.

Die Gesamt-RNA wurde aus der gesamten Lunge oder dem Nasenkompartiment unter Verwendung von Trizol-Reagenz (Thermo Fisher Scientific) isoliert. Nach der Reinigung wurde die RNA mit DNase behandelt und 0,5 μg RNA wurden unter Verwendung von PrimeScript RT Master Mix (Takara Bio Inc.) revers in cDNA transkribiert. Die quantitative PCR wurde dreifach unter Verwendung des SYBR-Green-PCR-Mastermixes (Thermo Fisher Scientific) und eines StepOne Real-Time-PCR-Systems (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Die spezifischen Primer (Hokkaido System Science, Co., Ltd., Sapporo, Japan), die für die Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) verwendet wurden, waren wie folgt: Rsv-f (vorwärts [F], 5‘ -aatgatatgcctataacaaatgatcagaa-3′; umgekehrt [R], 5′-tggacatgatagagtaactttgctgtct-3′); Rsv-g (F, 5′-ccaaacaaacccaataatgattt-3′; R, 5′-gcccagcaggttggattgt-3′); Il4 (F, 5′-aagaacaccacagagagtgagctc-3′; R, 5′-tttcagtgatgtggacttggactc-3′); Il5 (F, 5′-ctctgttgacaagcaatgagacg-3′; R, 5′-tcttcagtatgtctagcccctg-3′); Il13 (F, 5′-cctggctcttgcttgcctt-3′; R, 5′-ggtcttgtgtgatgttgctca-3′); Gapdh (F, 5′-tgacctcaactacatggtctaca-3′; R, 5′-cttcccattctcggccttg-3′); Actb (F, 5′-ggctgtattcccctccatcg-3′; R, 5′-ccagttggtaacaatgccatgt-3′). Gapdh und Actb wurden als mehrere interne Kontrollgene zur Normalisierung von Echtzeit-RT-PCR-Daten verwendet.

Faltenänderungen in der Transkriptexpression wurden berechnet, indem die Genexpression in den gesamten Lungen- oder Nasenkompartimentproben in jeder Immunisierungsgruppe verglichen wurde, wobei der Konzentration im jeweiligen Gewebe von Mäusen NI mit cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP ein Wert von 1 zugewiesen wurde .

Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurden von jeder Maus Lungen, Halslymphknoten und Milzen gesammelt, in vollständigem RPMI-Medium püriert und durch ein Zellsieb (Masche, 70 µm) geleitet. Nach 6-minütiger Zentrifugation bei 500 × g und 4 °C wurden CD90.2+ T-Zellen unter Verwendung eines MACS-Trennsystems (CD90.2 MicroBeads, Maus, Miltenyi Biotec, Nordrhein-Westfalen, Deutschland) gereinigt. Anschließend wurde die Anzahl der SHe-spezifischen IFNγ- oder Granzyme B-produzierenden T-Zellen mithilfe eines Enzyme-Linked-Immunospot-Assays (ELISPOT) bestimmt. Kurz gesagt, 96-Mikrowellplatten (MultiScreen; Merck, Darmstadt, Deutschland) wurden mit 5 μg/ml Anti-Maus-IFNγ (#551216, Klon R4-6A2, BD Biosciences, NJ, USA) oder 5 μg/ml Anti beschichtet -Maus Granzyme B (#AF1865, R&D Systems, MN, USA) über Nacht bei 4 °C. Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen und 1 Stunde lang bei 37 °C mit Komplettmedium blockiert. Anschließend wurden die T-Zellen jeder Probe zusammen mit den SHe-, SHe-konjugierten mit Rinderserumalbumin (SHe-BSA) oder SHe-PspA-gepulsten Antigen-präsentierenden Zellen der T-Zelle auf der vorab eingefangenen Platte kultiviert -abgereicherte Splenozytenpopulation (1,0 × 105/Well) bei 37 °C für 72 Stunden unter 5 % CO2. Um T-Zell-abgereicherte Splenozyten zu erhalten, wurden CD90.2−-Splenozyten von naiven BALB/c-Mäusen mithilfe des MACS-Trennsystems gereinigt, um die T-Zellen von den anderen Milzpopulationen zu trennen. Biotin-konjugiertes Ratten-Anti-Maus-IFN-γ (2 µg/ml; #554410, Klon sekundärer Antikörper. Die Spots wurden durch 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur mit 3-Amino-9-ethylcarbazol (Merck) in 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 5,0, mit 0,05 % H2O2 entwickelt.

FI-RSV wurde wie zuvor beschrieben92,93 mit geringfügigen Modifikationen hergestellt. Kurz gesagt, RSV A2 wurde mit Formalin (1:4000) 72 Stunden lang bei 37 °C inaktiviert. Anschließend wurde das mit Formalin behandelte RSV in serumfreiem Medium resuspendiert und die Inaktivierung von FI-RSV durch einen Immunplaque-Assay in HEp-2-Zellen bestätigt.

Ein Modell des FI-RSV VED wurde wie zuvor beschrieben40 erstellt. Kurz gesagt, BALB/c-Mäuse wurden einer primären Sensibilisierung mit FI-RSV (105 PFU-Äquivalent/Maus) und Imject Alum (Thermo Fisher Scientific) durch subkutane Injektion unterzogen. Drei Wochen später wurden die Mäuse dreimal jeden zweiten Tag durch intranasale Verabreichung mit FI-RSV (105 PFU-Äquivalent/Maus) sensibilisiert, gefolgt von einer abschließenden Infektion mit lebendem RSV (106 PFU/Maus) durch intratracheale Instillation (ergänzende Abbildung 6). ).

BALF-Proben wurden von Mäusen erhalten, die am Tag 8 nach der RSV-Exposition mit PBS, cCHP-[SHe-PspA]+cdAMP oder FI-RSV VED immunisiert worden waren, und ungefähr 2 × 106 Zellen aus den geernteten BALF-Zellsuspensionen wurden 10 Minuten lang mit inkubiert Fc-Rezeptor-Blocker (1:50; #553142, BD Biosciences) zur Verhinderung unspezifischer Bindung. Als nächstes wurden die geernteten BALF-Zellsuspensionen mit Anti-Siglec F (1:160; #63-1702-80, Thermo Fisher Scientific) und Anti-CD11b (1:160; #69-0112-80, Thermo Fisher Scientific) gefärbt. Antikörper, und dann 30 Minuten lang im Dunkeln bei 4 °C inkubiert. Die Daten wurden mit einem Attune NxT-Durchflusszytometer (Thermo Fisher Scientific) erfasst und mit dem FlowJo-Softwarepaket (TreeStar, Ashland, OR, USA) analysiert (Abb. 6b).

Lungenproben einzelner Mäuse wurden in 4 % (Gew./Vol.) Paraformaldehyd in PBS fixiert, in Paraffinblöcke (Fujifilm Wako Chemicals) eingebettet und in 5 µm dicke Schnitte geschnitten. Die Schnitte wurden dann mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, um die histopathologischen Veränderungen der Lunge bzw. die Infiltration von Eosinophilen zu beurteilen, wie zuvor beschrieben94.

RSV wurde mit Dynabeads Intact Virus Enrichment (#10700D, Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers so konjugiert, dass das RSV 1,0 × 107 PFU pro 1 µL Perlen betrug. Die RSV-Beads wurden dann mit 70 µL Nasenspüllösung von immunisierten Mäusen 0,5 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einer Färbung mit FITC-konjugiertem Anti-Maus-IgG (1:100; #115-096-062, Jackson ImmunoResearch) oder Biotin-konjugiertes Anti-Maus-IgA (1:1000; #1040-08, SouthernBiotech) und Allophycocyanin-Streptavidin (1:1000; #20-4317-U100, Tonbo Biosciences, San Diego, CA, USA). Die Antikörperbindung wurde durch Messung der Intensität der Fluoreszenzmarkierung mittels Durchflusszytometrie bewertet, und die mittlere Fluoreszenzintensität jeder Gruppe wurde gemessen und ausgedrückt, wobei der Wert für RSV-Beads allein auf 1 gesetzt wurde. Die durchflusszytometrische Analyse wurde unter Verwendung eines Attune NxT-Flusses durchgeführt Zytometer, und alle Daten wurden mit dem FlowJo-Softwarepaket analysiert (ergänzende Abbildung 3).

Mäuse und Baumwollratten wurden nur bei Bedarf durch Enthauptung unter Anästhesie mit einer Konzentration von 5 % oder mehr Isofluran (Muromachi Kikai Co., Ltd.) zur Probenentnahme eingeschläfert.

Vergleiche zwischen Gruppen wurden unter Verwendung des zweiseitigen Student-t-Tests (für die Analyse mit zwei Gruppen) und einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Tukey-Mehrfachvergleichstest (für die Analyse mit mehreren Gruppen) durchgeführt. Alle statistischen Analysen wurden mit der GraphPad Prism-Software Version 9.0 (GraphPad Software, San Diego, CA) durchgeführt. P-Werte unter 0,05 wurden als signifikant angesehen.

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien für die Verwendung und Pflege von Versuchstieren des Institute of Medical Science der Universität Tokio, Japan, durchgeführt und das Protokoll wurde vom Animal Care and Use Committee des Instituts genehmigt (Genehmigung Nr. PH3-33 für). Mäuse und #PA21-12 für Baumwollratten).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die ergänzenden Daten, die den Abbildungen zugrunde liegen. 1b, 2b–e, 3a–d, 4a–e, 5a–c, 6a, c und 7b–e sowie die ergänzenden Abbildungen 1a–f und 5a, b werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

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Diese Forschung wurde vom Grant-in-Aid for Scientific Research S (18H05280 an HK) der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) unterstützt; JSPS-Stipendium für wissenschaftliche Forschung B (20H03856 an KF); JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research C (22K07942 an DT); JSPS-Stipendium für wissenschaftliche Forschung, die Pionierarbeit in der Forschung fordert (20K20495 an KF); JSPS-Fonds zur Förderung gemeinsamer internationaler Forschung (18KK0432 an YK); JSPS-Fonds zur Förderung gemeinsamer internationaler Forschung (17KK0196 an DT); Japanische Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung (AMED) (JP21am0401029 an HK und 223fa627003h0001 an RN-O, YK, KF und HK); AMED-Projekt mit Schwerpunkt auf der Entwicklung von Schlüsseltechnologien zur Entdeckung und Herstellung von Medikamenten für die Behandlung und Diagnose der nächsten Generation (NeDDTrim) (JP21ae0121040 an HK); Future Medicine Fund der Universität Chiba (an YK); das Chiba University-UC San Diego Center for Mucosal Immunology, Allergy, and Vaccines (für YK, PE und HK); NIDDK-Zuschuss P30 DK120515 (für PE und HK); Internationales gemeinsames Nutzungs-/Forschungszentrum, Institut für Medizinische Wissenschaft, Universität Tokio (K22-3045 bis PE, YK, HK und KF); die Yamada Science Foundation (an YK); und eine 3-Millionen-Spende (an HK). Sponsoren hatten keine Kontrolle über die Interpretation, das Schreiben oder die Veröffentlichung dieser Arbeit. Wir danken allen Mitarbeitern unseres Labors für ihre technische Unterstützung und Diskussionen.

Abteilung für Schleimhautimmunologie, IMSUT Distinguished Professor Unit, Institut für Medizinische Wissenschaft, Universität Tokio, Tokio, Japan

Shingo Umemoto, Rika Nakahashi-Ouchida, Yosuke Kurashima und Hiroshi Kiyono

Abteilung für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde und Kopf- und Halschirurgie, Medizinische Fakultät, Universität Oita, Oita, Japan

Shingo Umemoto, Takashi Hirano und Masashi Suzuki

Chiba University-University of California San Diego Center for Mucosal Immunology, Allergy and Vaccine (CU-UCSD cMAV), Department of Medicine, School of Medicine, San Diego, CA, USA

Shingo Umemoto, Yosuke Kurashima, Daisuke Tokuhara, Peter B. Ernst und Hiroshi Kiyono

Abteilung für Schleimhautimpfstoffe, Internationales Forschungs- und Entwicklungszentrum für Schleimhautimpfstoffe, Institut für Medizinische Wissenschaft, Universität Tokio, Tokio, Japan

Rika Nakahashi-Ouchida, Yoshikazu Yuki, Shiho Kurokawa, Tomonori Machita, Yohei Uchida, Hiromi Mori und Tomoyuki Yamanoue

Abteilung für Vakzinologie der menschlichen Schleimhaut, Chiba University Hospital, Chiba, Japan

Rika Nakahashi-Ouchida, Yoshikazu Yuki, Shiho Kurokawa, Tomonori Machita, Yohei Uchida, Hiromi Mori, Tomoyuki Yamanoue, Kohtaro Fujihashi, Yosuke Kurashima und Hiroshi Kiyono

Chiba University Synergy Institute for Futuristic Mucosal Vaccine Research and Development, Chiba University, Chiba, Japan

Rika Nakahashi-Ouchida, Kohtaro Fujihashi, Yosuke Kurashima und Hiroshi Kiyono

HanaVax Inc, Tokio, Japan

Yoshikazu Yuki und Hiroshi Kiyono

Abteilung für Mikrobiologie, Medizinische Universität Tokio, Tokio, Japan

Takehiko Shibata

Abteilung für Immunologie, Nationales Institut für Infektionskrankheiten, Tokio, Japan

Takehiko Shibata

Abteilung für Polymerchemie, Graduate School of Engineering, Universität Kyoto, Kyoto, Japan

Shin-ichi Sawada und Kazunari Akiyoshi

Abteilung für Biochemikalien, Yamasa Corporation, Chiba, Japan

Kazuya Ishige

Abteilung für Schleimhautimpfstoffe, International Vaccine Design Center, Institut für Medizinische Wissenschaft, Universität Tokio, Tokio, Japan

Kohtaro Fujihashi & Yosuke Kurashima

Abteilung für Kinderzahnheilkunde, Universität von Alabama in Birmingham, Birmingham, AL, USA

Kohtaro Fujihashi

Institut für fortgeschrittene akademische Forschung, Universität Chiba, Chiba, Japan

Yosuke Kurashima

Abteilung für innovative Medizin, Graduate School of Medicine, Universität Chiba, Chiba, Japan

Yosuke Kurashima

Abteilung für Pädiatrie, Medizinische Universität Wakayama, Wakayama, Japan

Daisuke Tokuhara

Abteilung für vergleichende Pathologie und Medizin, Abteilung für Pathologie, University of California, San Diego, CA, USA

Peter B. Ernst

Zentrum für Veterinärwissenschaften und vergleichende Medizin, University of California, San Diego, CA, USA

Peter B. Ernst

Future Medicine Education and Research Organization, Universität Chiba, Chiba, Japan

Peter B. Ernst & Hiroshi Kiyono

Schleimhautimmunologie und Allergietherapeutika, Institut für weltweit bedeutende Forschung, Chiba-Universität, Chiba, Japan

Hiroshi Kiyono

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SU, RN-O. und YY waren für die Konzeptualisierung der Studie verantwortlich. SU, SK, TM, YU, HM, TY, TS, SI.S., KI, TH und DT waren für die Erstellung der Studienmethoden und die Durchführung der Untersuchungen verantwortlich. SU war für die Durchführung der statistischen Analysen verantwortlich. SU, RN-O., YY und HK waren für das Verfassen des Manuskripts verantwortlich. KF, KA, YK, DT, PE, MS und HK waren für die Durchsicht und Bearbeitung des Manuskripts verantwortlich. RN-O., YY, YK, KF und HK waren für die Finanzierungseinwerbung verantwortlich.

Korrespondenz mit Hiroshi Kiyono.

YY und HK sind Direktoren und Gründer von HanaVax Inc. RN-O., S.S. und KA sind wissenschaftliche Berater von HanaVax Inc. Die übrigen Autoren geben an, keine konkurrierenden Interessen zu haben.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Umemoto, S., Nakahashi-Ouchida, R., Yuki, Y. et al. Ein kationischer Nanogel-Nasenimpfstoff, der die Ektodomäne des kleinen hydrophoben RSV-Proteins enthält, induziert bei Nagetieren eine schützende Immunität. npj Vaccines 8, 106 (2023). https://doi.org/10.1038/s41541-023-00700-3

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Eingegangen: 21. Januar 2023

Angenommen: 22. Juni 2023

Veröffentlicht: 24. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41541-023-00700-3

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