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Jun 11, 2023

Eine einfache Methode zur Herstellung großvolumiger 3D-makroporöser Hydrogele für fortschrittliche biotechnologische, medizinische und ökologische Anwendungen

Scientific Reports Band 6, Artikelnummer: 21154 (2016) Diesen Artikel zitieren 12.000 Zugriffe 88 Zitate 5 Details zu altmetrischen Metriken Die Entwicklung von dreidimensionalen (3D) makroporösen Massenpolymeren

Scientific Reports Band 6, Artikelnummer: 21154 (2016) Diesen Artikel zitieren

12.000 Zugriffe

88 Zitate

5 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Die Entwicklung massiver, dreidimensionaler (3D), makroporöser Polymere mit hoher Permeabilität, großer Oberfläche und großem Volumen ist für eine Reihe von Anwendungen in den Bereichen Biomedizin, Biotechnologie und Umwelt äußerst wünschenswert. Die derzeit verwendeten experimentellen Techniken beschränken sich auf die Herstellung von Kryogelmaterial kleiner Größe und Volumen. In dieser Arbeit schlagen wir eine neuartige, vielseitige, einfache und reproduzierbare Methode zur Synthese großvolumiger poröser Polymerhydrogele durch Kryogelierung vor. Durch die Steuerung des Gefrierprozesses der Reagenz-/Polymerlösung wurden großformatige makroporöse 3D-Gele mit weiten, miteinander verbundenen Poren (bis zu 200 μm Durchmesser) und einer großen zugänglichen Oberfläche synthetisiert. Zum ersten Mal wurden makroporöse Gele (mit einem Schüttvolumen von bis zu 400 ml) mit kontrollierter poröser Struktur hergestellt, mit der Möglichkeit einer Skalierung auf viel größere Geldimensionen. Dieses Verfahren kann zur Herstellung neuartiger makroporöser 3D-Mehrkomponenten-Verbundmaterialien mit einer gleichmäßigen Verteilung eingebetteter Partikel verwendet werden. Das vorgeschlagene Verfahren ermöglicht eine bessere Kontrolle der Gefrierbedingungen und überwindet somit bestehende Nachteile, die die Produktion großer gelbasierter Geräte und Matrizen einschränken. Die vorgeschlagene Methode könnte als neues Designkonzept für die Herstellung funktioneller makroporöser 3D-Gele und Verbundwerkstoffe für biomedizinische, biotechnologische und Umweltanwendungen dienen.

Makroporöse Polymergele wurden in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt, darunter im Tissue Engineering, als Zellgerüste, in Bioreaktoren, Materialien für biologische und chemische Trennungen und als Adsorbentien in biomedizinischen und Umweltanwendungen. Porosität in Gelen kann durch verschiedene Ansätze erzeugt werden: Phasentrennung1 mittels sogenannter Porogene (chemische Zusätze, die Poren erzeugen), Lyophilisierung2,3, durch Schaumbildung und durch Kryogelierung4,5. Die letztgenannte Methode ist eine der vielseitigsten Techniken, die in den letzten Jahrzehnten zur Formung der porösen Struktur von Polymergelen5,6,7 eingesetzt wurde. Die Technologie ist einfach; Es erfordert im Allgemeinen nur einen Zyklus des Einfrierens und Auftauens der Reagenz-/Polymerlösung und ermöglicht die Herstellung von Materialien mit unterschiedlicher Morphologie, mechanischen Eigenschaften und Permeabilität8,9. Die Technik ist umweltfreundlicher als alternative Techniken, da das am häufigsten verwendete Lösungsmittel Wasser ist und keine Notwendigkeit besteht, organische Lösungsmittel zum Entfernen der porenbildenden Schablone zu verwenden. Das poröse Polymer entsteht im halbgefrorenen Zustand, wenn der größte Teil des Lösungsmittels verfestigt ist und bei Temperaturen unter dem normalen Gefrierpunkt Lösungsmittelkristalle bildet, wobei die Polymerisation in den interkristallinen Kanälen stattfindet, die die nicht gefrorene Lösung enthalten. Eine Erhöhung der Temperatur nach Abschluss der Polymerisation führt zum Auftauen der Lösungsmittelkristalle und zur Bildung miteinander verbundener Hohlräume (Makroporen) in der mit dem Lösungsmittel gefüllten Polymerstruktur. Besonderes Interesse besteht aufgrund der hohen Permeabilität (und folglich des geringen Strömungswiderstands) von aus wässrigen Lösungen hergestellten Gelen und ihrer Fähigkeit, Mikro- und Makropartikel ohne Verstopfung und Porenverstopfung zu filtern10. Dies eröffnet die Möglichkeit, Geräte für die Zell- und Biopartikeltrennung10,11,12,13, direkte Blutperfusion14, Tissue Engineering15,16,17,18,19,20, Wasseraufbereitung21,22,23 und Bioreaktoren24,25,26 zu entwickeln. Trotz der weit verbreiteten Verwendung der Kryogelierungstechnik zur Herstellung makroporöser Gele ist das Phänomen des Gefrierens der anfänglichen Reagenzlösung und der Bildung von Lösungsmittelkristallen nicht vollständig verstanden. Während einige Fortschritte bei der Kontrolle der Lösungsmittelkristallgröße in kleinen Proben durch Variation der Kühltemperatur und der Kühlgeschwindigkeit oder der Zusammensetzung der Reagenzmischung erzielt wurden, um Strukturen mit Porengradienten und anisotropen Poren zu erzeugen27, gibt es eine anerkannte Schwierigkeit bei der Kontrolle der Eiskeimbildung und der damit einhergehenden Kontrolle die Gefrierkinetik und die Eiskristallbildungsbedingungen in der Masse größerer Proben. Dies führt zu einer schlechten Kontrolle der Morphologie der resultierenden makroporösen Gele, insbesondere in größeren 3D-Strukturen. Tatsächlich wurden alle bisher durchgeführten Arbeiten im Labor und im kleinen Maßstab durchgeführt. Bisher hergestellte Gele sind klein (einige Milliliter Volumen oder haben mindestens eine kleine Abmessung (ca. 2 cm oder weniger)) oder weisen eine variable Porengrößenverteilung in der Probe auf. Für größere Trennungen oder technische/biotechnologische Anwendungen ist eine einfache und reproduzierbare Methode zur Herstellung großvolumiger makroporöser Gele mit verbesserter Kontrolle der Porenstruktur und Permeabilität erforderlich. Eine weitere Einschränkung betrifft die Herstellung großer makroporöser Verbundmaterialien mit Nano- und Mikropartikeln, die in eine dreidimensionale durchlässige Matrix eingebettet sind. Die Dichte der wässrigen Vorläuferlösungen, die für die Gelbildung mittels der Kryogelierungsmethode verwendet werden, ist in der Regel sehr gering, daher stellt die Gewährleistung einer gleichmäßigen Verteilung dichter Nano- oder Mikropartikel in Gelen besondere Schwierigkeiten dar. Die Partikel trennen sich während des Gefriervorgangs, was zum vollständigen Versagen des Verbundwerkstoffs oder zur Bildung makroporöser Gele mit ungleichmäßiger Partikelverteilung führt8. Dieser Artikel untersucht das Gefrieren von Gelsystemen und die Beziehung zwischen den Gefrierbedingungen und der Morphologie des gebildeten Gels. Die Wärmeübertragung in der Masse großer Proben wird bewertet und eine neuartige Methode vorgeschlagen, bei der ein großes Volumen der Reagenzlösung vor Beginn der Gelbildung vorgefriert wird. Zum ersten Mal demonstrieren wir die Herstellung großvolumiger (400 ml oder mehr) makroporöser Gelproben und Verbundwerkstoffe mit effektiver und reproduzierbarer Kontrolle der porösen Struktur. Dieser Ansatz eröffnet neue Möglichkeiten zur Herstellung großvolumiger Gele für fortgeschrittene Trenn-, Adsorptions- oder Strukturanwendungen sowie zur Erzeugung neuartiger 3D-Strukturen mit eingebetteten Mikro- und Nanopartikeln.

Makroporöse Gele wurden durch Kryogelierung hergestellt, wobei die anfängliche gelbildende Lösung eingefroren und die Polymerisation oder Gelbildung bei Temperaturen von 12–18 Grad unter dem Gefrierpunkt des Lösungsmittels durchgeführt wurde (Abb. 1a).

Eine schematische Darstellung der Methode zur Kryogel-Herstellung nach der herkömmlichen Methode (a) und dem hier beschriebenen neuen Ansatz (Vorgefrieren) (b).

Lösungsmittelkristalle (Eiskristalle), die beim Gefrieren des Lösungsmittels entstehen, wirken als Porogen. Nach dem Auftauen des Materials bilden sich mit Wasser gefüllte Poren. Um ein makroporöses Gel zu erhalten, müssen die Lösungsmittelkristalle gebildet werden, bevor sich das Gel bildet. Um den Temperaturgradienten zu reduzieren und auch die Reaktion, die zur Gelbildung führt, zu verlangsamen, wurde die Reagenzlösung vor der Zugabe des Initiators oder Vernetzers in Eis vorgekühlt und außerdem wurde die Initiatorkonzentration reduziert, um die Polymerisation selbst zu verlangsamen . Nach dem Auftauen bildete sich das makroporöse Gel. Die Gelmorphologie hing von der Abkühlgeschwindigkeit und der Gelgeometrie ab. Wenn ein Gel in einer Petrischale hergestellt wurde, die in ein kühlendes Ethanolbad getaucht war, beginnt das Gefrieren am Boden der Schale, wo sich schnell kleine Eiskristalle bilden, was zur Bildung kleinerer Poren mit einer durchschnittlichen Größe von 30 μm führt (Abb. 2A, unten). An der Oberseite der Probe war die Abkühlung langsamer, so dass mehr Zeit für das Eiskristallwachstum blieb, was zur Bildung größerer Poren von 76 μm führte (Abb. 2A, oben). Die Größe der Probe betrug nur wenige (ca. 2) Millimeter. Es ist daher nicht überraschend, dass eine Vergrößerung der Probengröße zu einem größeren Temperaturgradienten in der Probe und zu großen Schwankungen in der Gelmorphologie führt.

(A) Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM)-Bild eines Querschnitts von Gelatine-Hydrogel, vorbereitet in einer Petrischale. Das Gefrieren begann am Boden der Petrischale, wo sich kleine Poren bildeten, während sich größere Poren beim Kontakt mit Luft bildeten (oben). Der Maßstabsbalken beträgt 500 mm. (B) In HEMA-Kryogelproben gemessene Temperaturprofile: a) vier verschiedene Proben à 5 ml, b) und c) 100 ml-Probe, hergestellt nach herkömmlicher Methode; und d) 100 ml Probe nach Vorgefrieren.

Die Temperaturprofile während des Einfrierens von 5 ml Poly(2-hydroxyethylmethacrylat-polyethylenglykol) (pHEMA)-Proben mit einem Durchmesser von 10 mm bei –12 °C wurden mit einem in der Mitte der Probe eingesetzten Temperatursensor aufgezeichnet (Abb. 2B,a). ). Die Temperaturprofile variieren von Probe zu Probe und zeigen die Komplexität des Gefrierprozesses und seine Abhängigkeit vom Keimbildungspunkt oder dem Punkt, an dem Eiskristalle zu wachsen beginnen. Drei Proben wurden zunächst unterkühlt und blieben ungefroren, als die Temperatur unter den normalen Gefrierpunkt des Lösungsmittels gesenkt wurde. Folglich waren die Zeitpunkte, zu denen die Keimbildung und das Gefrieren einsetzten, leicht unterschiedlich. Die Temperaturprofile, die durch das Einfrieren von 100 ml pHEMA-Kryogel in einem Becherglas mit einem Durchmesser von 120 mm erzeugt wurden, wurden ebenfalls aufgezeichnet (Abb. 2B, b und c). Temperatursensoren wurden an verschiedenen Stellen der Probe angebracht und zeigen je nach Position unterschiedliche Temperaturen an. Die erste Lösung wurde auf 0 °C abgekühlt, bevor der Initiator zugegeben wurde. Es ist zu beobachten, dass die Lösung zunächst auf –2 bis –6 °C unterkühlt war. Sobald die Kristallisation einsetzte, stieg die Temperatur wieder auf –0,6 °C. Die schnellsten Temperaturänderungen traten am Rand des Becherglases auf (Serie 1), wo die Temperatur schnell abnahm, während sich in der Mitte der Probe das Abkühlen und Gefrieren um 40–70 Minuten verzögerte (Serie 4 und 6). Da der Initiator beim anfänglichen Abkühlen zugegeben wurde, beginnt die Polymerisation gleichzeitig mit dem Abkühlen der Probe. Da die Polymerisation typischerweise in etwa 30 Minuten abgeschlossen ist, hat die Verzögerung der Kristallbildung erhebliche Auswirkungen auf die Gelmorphologie. Die Gefrierbedingungen am Probenrand und in der Probenmitte waren sehr unterschiedlich. Die Keimbildung beginnt am Rand der Probe und ihre Verzögerung in der Mitte führt zum Ausschluss und zur Vorkonzentration eines größeren Teils der nicht gefrorenen Monomer-Polymer-Lösung in der Mitte, was zur Bildung längerer Poren und dickerer Polymerwände führt und geringere Integration. Daher weisen Gele eine uneinheitliche Morphologie auf und sind zudem zerbrechlicher.

Um das Gefrieren großer Volumina wirksam zu kontrollieren, wurde ein teilweises Einfrieren oder „Vorgefrieren“ der Mischung vor Beginn der Gelbildung durchgeführt (Abb. 1b). Wir weisen darauf hin, dass es möglich ist, die Lösung bei Temperaturen unterhalb des Gefrierpunkts des Lösungsmittels teilweise einzufrieren und das Lösungsmittel bei ständigem Mischen kristallisieren zu lassen. Zwischen 50 und 90 % des Lösungsmittels können ausgefroren werden, wobei die gelbildenden Reagenzien in der nicht gefrorenen flüssigen Phase verbleiben. Das Mischen der Reaktionslösung verbessert den Wärmeübergang und die Eiskeimbildung. Dies ermöglicht sogar das Einfrieren großer Volumina an Reaktionslösung. Die Temperaturprofile der vorgefrorenen Probe (Abb. 2B,d) ähneln den Temperaturprofilen, die mit der herkömmlichen Methode erstellt wurden. In der vorgefrorenen Probe ist jedoch der größte Teil des Lösungsmittels kristallisiert und die Eiskristalle sind gleichmäßiger in der Probe verteilt, wodurch eine Umgebung entsteht, die einem vollständig gefrorenen Block ähnelt. Der Initiator wurde nach dem Vorgefrieren der Lösung zugegeben, wodurch die Polymerisation verzögert wurde und in kleinen, durch Eiskristalle getrennten Bereichen der nicht gefrorenen flüssigen Phase stattfand. Die Wärmeübertragung in diesen Proben hängt mit dem Ausfrieren kleiner Volumina der Reagenzlösung und dem Abkühlen der Probe selbst zusammen. Wir fanden heraus, dass das Vorgefrieren die Herstellung poröser Gele mit großem Volumen und nahezu gleichmäßiger Porosität über das gesamte Probenvolumen ermöglicht (Abb. 3). Ein 400-ml-pHEMA-Kryogel wurde als ein zylindrisches Stück mit den Abmessungen Durchmesser 2,5 mm hergestellt. 6 × 10 cm (Abb. 3a). Das Gel hat über sein gesamtes Volumen eine makroporöse Struktur mit miteinander verbundenen Poren im Größenbereich von 20–200 μm (Abb. 3e, f). Das herkömmliche Gel hat ebenfalls eine makroporöse Struktur (Abb. 3), aber die Porenmorphologie war anders: In der Mitte und an der Oberseite der Probe bildeten sich längere längliche Poren. Das herkömmliche Gel ist schwächer: Sein Kompressionsmodul beträgt 6 kPa, verglichen mit 12 kPa für das mit der Vorgefriermethode hergestellte Gel (Tabelle 1). Die Porosität der mit beiden Methoden hergestellten Kryogele wurde mittels Quecksilberporosimetrie analysiert (Abb. 3f). Drei Bereiche in den mit beiden Methoden hergestellten Gelen wurden für die Analyse ausgewählt: oben, in der Mitte und unten. Beide Geltypen haben Makroporen im Bereich von 20–200 μm. Die Porengrößenverteilung war bei den Bodenproben ähnlich, wahrscheinlich aufgrund der Ähnlichkeit der Gefrierbedingungen. Die mittleren und oberen Proben der mit der Vorgefriermethode hergestellten Gele weisen jedoch im Vergleich zu herkömmlichen Gelen eine viel engere Porengrößenverteilung auf. Die im Vorgefrierverfahren hergestellten HEMA-Gele weisen außerdem ein größeres Porenvolumen im Vergleich zum herkömmlichen Gel auf (Tabelle 1).

Poly(2-hydroxyethylmethacrylat-polyethylenglykol), pHEMA, zylindrisches Gel (400 ml), hergestellt nach der konventionellen (links) und Vorgefriermethode (rechts) (a) und seinen Querschnitten (b) – konventionell, ( c) – Vorgefrieren), (d) zeigt konfokale Laser-Rastermikroskop-Querschnittsbilder eines herkömmlichen Gels, während (e) Rasterelektronenmikroskopbilder eines mit der Vorgefriermethode hergestellten Gels zeigt, (f) Poren zeigt Größenverteilung in drei Teilen des Gels: oben, in der Mitte und unten.

Die Morphologie des mit der Vorgefriermethode erhaltenen pHEMA-Gels unterschied sich deutlich von der mit der herkömmlichen Methode hergestellten (Abb. 4). Im herkömmlichen Kryogel waren die Gelwände glatt und es wurde keine Aggregation des Polymers beobachtet (Abb. 4). Bei der herkömmlichen Methode gefrieren kleine Volumina der HEMA-Lösung normalerweise schnell, bevor die Polymerisation einsetzt, sodass die Polymerisation in hochkonzentrierten Lösungen mit kleinem Volumen und begrenzter Diffusion des Polymers erfolgt. Dadurch entsteht ein Polymer mit glatten Wänden. Beim Vorgefrierverfahren wird der Initiator zu einer bereits vorkonzentrierten Lösung gegeben, was zu einer schnellen Polymerisation unter halbgefrorenen Bedingungen und anschließender Phasentrennung des gebildeten Polymers in der flüssigen Phase führt. Eine zusätzliche Phasentrennung zwischen dem gebildeten Polymer und dem Lösungsmittel führte zur Bildung einer komplexeren Struktur aus Polymeraggregaten, die in einer 3D-Struktur fixiert waren. REM-Bilder zeigen eine einzigartige 3D-Struktur mit einer Kombination aus Makro- und Mikroporen in der Polymerwand (Abb. 4) und die Analyse der Porosität zeigt eine größere Oberfläche (Tabelle 1). Diese doppelte Porositätsstruktur hängt von den thermischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften der bei der Herstellung der Gele verwendeten Monomere ab: Ein mit der Vorgefriermethode hergestelltes Polyacrylamid (pAAm)-Kryogel (Abb. 4) zeigte eine ähnliche Morphologie wie mit der herkömmlichen Methode hergestellte Proben Methode (Daten nicht angezeigt).

REM-Bilder eines pHEMA-Kryogels, das mit der herkömmlichen Methode und der Vorgefriermethode hergestellt wurde, und eines Polyacrylamid (pAAm)-Kryogels, das mit der Vorgefriermethode hergestellt wurde (die Morphologie des mit der herkömmlichen Methode hergestellten pAAm-Gels war ähnlich, Daten nicht gezeigt).

Verbundwerkstoffe auf Gelbasis, die Eisenoxid-Nanopartikel (α-Fe2O3, 20 nm, Arry International) und Mikropartikel aus Aktivkohle (250–500 μm, MAST Carbon) enthielten, wurden mit herkömmlichen Methoden und Vorgefriermethoden hergestellt. Die Partikel wurden in der Reaktionslösung suspendiert und in zwei Teile geteilt. Dem ersten Teil wurde Initiator zugesetzt und die Probe in eine Kühlkammer bei –18 °C gestellt (konventionelle Methode). Der zweite Teil der Suspension wurde auf −18 °C abgekühlt und ständig gemischt, bis das Lösungsmittel kristallisierte und eine Eisaufschlämmung bildete. Nach der Bildung einer dicken Aufschlämmung aus Eis und Partikeln wurde der Initiator zugegeben und die Probe bei –18 °C eingefroren (Vorgefriermethode). Während der Vorgefriermethode wurde die Phasentrennung der Partikel verhindert, wodurch die Partikelverteilung über das gesamte Gelvolumen verbessert wurde. Abbildung 5 zeigt visuell, dass die Partikel bei Verwendung der Vorgefriermethode gleichmäßig in der Probe verteilt waren (Abb. 5a,b, rechtes Reagenzglas). In einem nach herkömmlicher Methode hergestellten Gel neigen die Partikel aus Eisenoxid und Kohlenstoffkügelchen dazu, sich am Boden abzusetzen und Gele mit ungleichmäßiger Partikelverteilung zu bilden (Abb. 5a, b, linkes Reagenzglas). Die Analyse der Eisenoxidpartikelkonzentration in drei Proben eines 140-ml-Kryogels, das in einer 150-ml-Spritze hergestellt wurde, zeigt eine gleichmäßige Verteilung der Partikel im oberen, mittleren und unteren Teil des Gels (Tabelle 1). Die Partikelkonzentration betrug etwa 0,37 ± 0,02 g/g getrocknetes Gel. Das Gel hat eine Porengrößenverteilung zwischen 20 und 200 μm (Abb. 5), ein Porenvolumen von 3,65 ± 0,45 cm³/g und eine Oberfläche von 0,198 ± 0,029 m2/g (Tabelle 1). Ein weiteres Beispiel ist ein Kohlenstoffnanoröhren-Kryogel-Verbundwerkstoff. Während der Kompositherstellung neigen Kohlenstoffnanoröhren dazu, an die Oberfläche der Lösung zu schwimmen und erfordern spezielle Verfahren, um ihre Dispersion in der wässrigen Lösung zu erhöhen. Die Vorgefriermethode ermöglicht die Herstellung großer Verbundwerkstoffe mit einer gleichmäßigen Verteilung der Nanoröhren, ohne dass eine CNT-Behandlung zur Verbesserung der Dispersität erforderlich ist (Abb. 5c, d).

Polyacrylamid-Kryogel-Verbundwerkstoffe. (a) mit α-Fe2O3-Nanopartikeln (20 nm) und (b) mit Aktivkohlekügelchen (250–500 mm), hergestellt nach der herkömmlichen Methode (linkes Reagenzglas) und hergestellt durch Vorgefrieren der Suspension vor Beginn der Polymerisation ( rechtes Reagenzglas). Das Polyacrylamid-Kryogel-Komposit mit Kohlenstoffnanoröhren (c) und sein Querschnitt (d). α-Fe2O3-AAm-Säule, hergestellt nach der Vorgefriermethode (140 ml Volumen) und der herkömmlichen Methode (1 ml Volumen) (e). Adsorption von As(III) durch 4 und 140 ml Säule (f). Porengrößenverteilung (g). Zur Diskussion siehe Text.

Eine mit α-Fe2O3-Eisennanopartikeln beladene Verbundsäule (140 ml) wurde mit der Vorgefriermethode für die Durchflussanwendung vorbereitet (Abb. 5e). Die Säule wurde auf Adsorption von As(III) aus wässriger Lösung getestet und mit einer 4-ml-Säule verglichen, die nach der herkömmlichen Methode hergestellt wurde. Die 4-ml-Säule wurde durch Zusammenstapeln von 4 Stücken eines 1-ml-Gels erhalten. Die kleinen Kryogelstücke (1 ml) wurden vorbereitet, um eine gleichmäßige Nanopartikelverteilung aufrechtzuerhalten. Eine Lösung von 10 mg/l As(III) wurde mit einer Flussrate von 10 ml/min durch die Säule gepumpt. Das Durchbruchprofil für die 4-ml-Säule (Flussrate 4 ml/min) und die 140-ml-Säule (Flussrate 10 ml/min) zeigt eine effektive Vergrößerung des Adsorptionsprozesses durch die Verwendung der großen Säule, die von der Vorstufe hergestellt wurde. Gefriermethode (Abb. 5f).

Die Morphologie makroporöser Gele, die durch Kryogelierung hergestellt werden, hängt von der Lösungsmittelkristallisation, der Größe der gebildeten Lösungsmittelkristalle und der Phasentrennung zwischen dem gefrorenen Lösungsmittel (Eis, wenn Wasser als Lösungsmittel verwendet wird) und einer reaktiven Gelvorläuferlösung (nicht gefrorene Flüssigkeit mit Monomeren) ab , Polymere, Vernetzer und Initiator vorkonzentriert)5,8. Die Gefriergeschwindigkeit und die Gefriertemperatur beeinflussen die Bildung und das Wachstum von Eis und steuern somit die Porosität des Gels28. Bei niedrigeren Temperaturen und schneller Kinetik der Eiskeimbildung bilden sich Gele mit kleineren Poren (Abb. 6). Beispielsweise wird häufig Stickstoffschlamm verwendet, um Proben schnell einzufrieren und das Wachstum von Eiskristallen zu verhindern. Bei der Synthese makroporöser Materialien werden jedoch normalerweise Temperaturen im Bereich von –10 bis –25 °C für wässrige Systeme verwendet, um das Wachstum größerer Lösungsmittelkristalle zu ermöglichen7. Die Gefriergeschwindigkeit wird in der Literatur häufig als zeitliche Abnahme der Temperatur bezeichnet, die durch die Kühlausrüstung gesteuert wird. Es ist jedoch wichtiger, die tatsächliche Gefriergeschwindigkeit von Lösungen im Hinblick auf ihren Übergang von flüssig zu fest und die dabei auftretende Phasentrennung zu berücksichtigen. Praktische Experimente zeigen, dass Lösungen oft auf Temperaturen unter dem Gefrierpunkt abkühlen, bevor die Kristallisation einsetzt, was als Unterkühlung bezeichnet wird (Abb. 2 und 6). Wenn sich der erste Eiskeim bildet, steigt die Temperatur in der Probe auf eine Übergangstemperatur Tf, die niedriger ist als der Gefrierpunkt des reinen Lösungsmittels. Die Abkühlungsgeschwindigkeit bestimmt die Anzahl der Keimbildungsstellen und die Größe der Eiskristalle. Es ist offensichtlich, dass die Probengeometrie (dh die Abmessungen des Wärme- und Stofftransfers) bei diesem Prozess berücksichtigt werden muss. Aufgrund der langsameren Gefriergeschwindigkeit in der Mitte einer großen Probe im Vergleich zu den Rändern beginnt die Lösungsmittelkristallisation am Probenrand und in der Hauptprobe zu unterschiedlichen Zeiten (Abb. 2B, b und c). Dies führt zur Bildung von Gelen mit unterschiedlichen Morphologien und Porengrößen in der gesamten Probe8. Das Einfrieren einer 2 mm großen Gelatineprobe führt zu einer Porenverteilung zwischen 30 und 76 μm (Abb. 2A). Das Einfrieren großer Mengen ist noch komplizierter. Wie wir in unseren Experimenten zeigen, kann die Gefrierzeit zwischen 20 und 70 Minuten variieren. Dies wird entscheidend, wenn gleichzeitig die Polymerisation oder Gelbildung gestartet wird. Somit laufen beide Prozesse (Gefrieren und Gelbildung) gleichzeitig ab und die Zeit für den längeren Prozess (Lösungskühlung und Eiskristallbildung) wird zur Begrenzung. Das Einfrieren großer Volumina dauert länger als die Gelbildung. In dem Moment, in dem die Eiskeimbildung in der Mitte einer großen Probe beginnt, wird das Gel gebildet. Das Problem des gleichmäßigen Einfrierens großer Volumina führt zu starken Einschränkungen bei der Herstellung großer makroporöser Geräte auf Gelbasis. Als eine Lösung zur Herstellung großer Säulen wurde der Ansatz vorgeschlagen, Scheiben, die durch Einfrieren von in einer Dimension kleinen Proben hergestellt wurden, übereinander zu stapeln (d. h. als modulare Säulenvorrichtung)21. Allerdings ist die Technologie mühsam und erfordert zusätzliche Schritte bei der Gerätekonstruktion, was für die praktische Vorbereitung in größeren oder industriellen Maßstäben nicht ideal ist. Wir schlagen hier eine Vorgefriermethode mit ständigem Mischen der Lösung vor, die die Gefrierzeit nicht unbedingt verkürzt, aber die Eiskeimbildung und die Verteilung von Eiskristallen in der Probe erleichtert und den Beginn der Polymerisation oder Gelbildung verzögert. Bei dieser Vorgefriermethode lässt man das Lösungsmittel zunächst kristallisieren, bevor der Initiator oder das Vernetzungsmittel zugegeben wird. Das Vorgefrieren kann je nach Volumen und Form der betreffenden Mischung Minuten bis Stunden dauern. Da sich jedoch Lösungsmittelkristalle bilden, bevor die Polymerisation oder Gelbildung eingeleitet wird, hängt die Gefrierstufe nicht von der Gelbildungsrate ab. Die Gelbildung wird erst eingeleitet, wenn der Großteil des Lösungsmittels ausgefroren ist. Dadurch werden die Lösungsmittelkristalle gleichmäßig über das gesamte Probenvolumen verteilt, was zur Bildung großvolumiger Gele mit besserer Porengrößenverteilung und besseren mechanischen Eigenschaften führt. Somit stellt das Vorgefrieren eine einfache und elegante Lösung für das Einfrieren großer Proben und die Herstellung großformatiger makroporöser 3D-Gele dar, die sowohl für großmaßstäbliche Laboranwendungen als auch für die industrielle Produktion geeignet sind. Die Analyse der Struktur einer 400 ml pHEMA-Gelprobe zeigt das Vorhandensein großer, miteinander verbundener Poren entlang der gesamten Probe (Abb. 3). Die Porengrößenverteilung zeigt die Bildung von Poren im Bereich von 20–200 μm. Das herkömmliche Gel hat eine breitere Porengrößenverteilung und ist schwächer und zerbrechlicher. Bemerkenswert ist, dass das Vorgefrieren der Lösung Bedingungen für die Phasentrennung des in der nicht gefrorenen flüssigen Phase gebildeten Polymers und die Bildung neuer Strukturen in pHEMA-Gelen schafft. In dieser Arbeit haben wir ein pHEMA-Gel mit doppelter Porosität und einer komplexen 3D-Struktur aus großen Makroporen (von 20–200 μm) und kleineren Poren in der Polymerwand erhalten, wodurch die Wände durchlässig werden und die Polymeroberfläche vergrößert wird. Dieses Material ist für biologische Anwendungen von besonderem Interesse: pHEMA-Gele sind bekannte biokompatible Polymere, die gute Zelladhäsions- und Proliferationseigenschaften gezeigt haben. Die Gele mit zusätzlicher Durchlässigkeit aufgrund der zusätzlichen Porosität in den Porenwänden können einen besseren Nährstoffaustausch und dadurch ein verbessertes Zellwachstum ermöglichen. Solche Polymer-Kryogele können in der Form des gewünschten menschlichen Gewebes oder Organs hergestellt werden, was interessante Möglichkeiten für ihren Einsatz in der regenerativen Medizin eröffnet. Auch makroporöse Verbundmaterialien mit einer gleichmäßigen Partikelverteilung, die nicht leicht eine stabile Suspension bilden, wurden mit der Vorgefriermethode hergestellt. Dies ist bei Anwendungen wertvoll, bei denen zusätzliche Reaktivität oder Adsorptions-/Trennfunktionalität durch den Einbau nicht agglomerierter, reaktiver Partikel in die Polymerwände erforderlich ist21,22,29. Die beim Vorgefrierschritt gebildeten Misch- und Lösungsmittelkristalle verhindern die Trennung der Partikel von der Lösung und verbessern ihre Verteilung entlang der gesamten Probe (Abb. 5). Im Gegensatz dazu führt das Fehlen einer stabilen Suspension in Kryogelen, die mit herkömmlichen Methoden hergestellt wurden, zu einer Partikeltrennung im endgültigen Verbundwerkstoff21,30. Die herkömmliche Herstellungsmethode ist für die Herstellung von Verbundwerkstoffen ungeeignet, wenn die Partikel eine Dichte aufweisen, die erheblich von der der ursprünglichen Lösung abweicht, oder wenn die Partikel groß sind. Beispielsweise führt die Herstellung von Verbundwerkstoffen mit eingearbeiteten Kohlenstoffkügelchenmaterialien oder Kohlenstoffnanoröhren zur Bildung von Gelen, bei denen sich die Partikel oben (leichte Partikel) oder unten (dichte oder große Partikel) des Gels konzentrieren. Eine Erhöhung der Viskosität der ursprünglichen Lösung oder die Zugabe von Tensiden kann zur Verbesserung der Partikeldispersion beitragen. Dies ist jedoch nicht immer wünschenswert, da eine Erhöhung der Viskosität die endgültige Porenstruktur beeinflusst und Gele, die aus einer Lösung mit hohem Monomer- oder Polymergehalt hergestellt werden, kleinere Poren aufweisen. Darüber hinaus führt ein schnelles Einfrieren der Proben im Sinne einer Verkürzung der Gefrierzeit zur Begrenzung der Trennung oder des Absetzens zu Gelen mit kleineren Poren. Für viele Zusammensetzungen ist es praktisch schwierig, Bedingungen zu schaffen, die die Partikeltrennung verhindern. Hier zeigen wir, dass die Vorgefriermethode eine einfache und effiziente Methode zur Steuerung der Partikelverteilung ist, ohne die Bildung großer Poren zu beeinträchtigen. Diese Erkenntnis eröffnet Möglichkeiten zur Entwicklung neuartiger Verbundmaterialien mit großen Poren und Oberflächen, die eine bessere Adsorptions- und Trennleistung bieten. Daher haben wir eine α-Fe2O3-AAm-Verbundsäule mit einem Gesamtvolumen von 140 ml vorbereitet. Unsere vorherige Studie zeigt das Potenzial der Verwendung makroporöser Gele als Gerüst für Eisenoxid-Nanopartikel zur Herstellung reaktiver Nanokompositgeräte und ihre Effizienz bei der As(III)-Adsorption aus wässrigen Lösungen. Die Anwendung war jedoch auf Verbundwerkstoffe kleiner Größe beschränkt, wobei eine 4-ml-Säule durch Zusammenstapeln von 4 separaten Teilen des getesteten Gels erhalten wurde. Hier vergrößern wir die Säulengröße auf 140 ml und demonstrieren eine effektive Adsorption in einem größeren Maßstab. Wir glauben, dass die Säulengröße in der Industrie noch weiter vergrößert werden könnte. Zusammenfassend wurde ein neuartiger Ansatz zur Steuerung der Wärmeübertragung in großvolumigen Proben und zur Synthese großformatiger makroporöser 3D-Hydrogelmaterialien entwickelt. Darüber hinaus können mit der Technologie mehrkomponentige, 3D-strukturierte Verbundwerkstoffe mit verbesserter Verteilung des Partikelmaterials synthetisiert werden. Die vorgeschlagene Methode bietet das Potenzial, verschiedene anspruchsvolle mikro-/makroporöse Mehrkomponentenstrukturen unterschiedlicher Größe und Form zu entwerfen, die ein großes Potenzial für verschiedene Anwendungen in den Bereichen Biomedizin, Biotechnologie und Umwelt haben könnten.

Schematische Darstellung des Gefriervorgangs: Die Abkühlung beginnt bei Temperatur A und die Lösung unterkühlt auf B. Bei B beginnt die Keimbildung und die Temperatur steigt auf C (Gefriertemperatur, Tf). Die Kristallisation und Konzentration des gelösten Stoffes in der nicht gefrorenen Flüssigkeit setzt sich fort, bis D, die Zieltemperatur, erreicht ist.

Gelatine-Hydrogel-Platten (G-Gel) wurden in einer Glasform hergestellt. Glutaraldehyd (3 % v/w) wurde der Gelatinelösung (6 % w/w) zugesetzt. Die Lösung wurde in die Glasform gegeben und 20 Stunden lang in einer Julabo-Kühlkammer bei –12 °C eingefroren. Anschließend wurde es aufgetaut und mit einem Überschuss an Wasser gewaschen. 2-Hydroxyethylmethacrylat-Gele wurden durch Auflösen von 2-Hydroxyethylmethacrylat (HEMA, Acros Organic, 98 %) und Polyethylenglykoldiacrylat (PEGDA, Aldrich, Mn ~258) in Wasser (6 w/v % Lösung, HEMA: PEGDA-Molverhältnis 8:1). Die Reaktionsmischung wurde 25 Minuten lang bei niedrigem Druck entgast, um gelösten Sauerstoff vor der Gelierung zu entfernen. Bei der herkömmlichen Methode wurde die Mischung 15 Minuten lang auf 0 °C abgekühlt und dann N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin (TEMED, Fisher Scientific, 99 %) und Ammoniumpersulfat (APS, 98 %) zugegeben und die Mischung vollständig gefrieren lassen. Bei der Vorgefriermethode wurde die Mischung unter ständigem Mischen in einem Ethanol-Kühlbad bei –18 °C abgekühlt. Nachdem sich Eiskristalle gebildet hatten, wurde die Mischung unter ständigem Mischen auf −2 °C vorgekühlt. N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin (TEMED, Fisher Scientific, 99 %) und Ammoniumpersulfat (APS, 98 %) wurden zugegeben und die Mischung vollständig gefrieren lassen. Die gefrorene Mischung wurde 20 Stunden lang bei –18 °C gehalten und dann bei Raumtemperatur aufgetaut.

Eisenoxid-Nanopartikel-Komposite wurden durch Auflösen von 4,8 g Acrylamid (AAm, Sigma-Aldrich, 99 %) und 1,6 g N,N′-Methylenbisacrylamid (MBAA, Sigma-Aldrich, 96 %) in 100 ml Wasser hergestellt. Die Lösung wurde 20 Minuten lang entgast. Eisenoxid-Nanopartikel (α-Fe2O3, Arry International Group Limited, Partikelgröße 30 nm), 10 g und TEMED 0,01 ml wurden zugegeben. 10 ml der Suspension wurden in ein Glasröhrchen gegeben und 0,007 g APS zugegeben. Nach dem Mischen wurde das Glasrohr in ein Kühlbad bei −18 °C gestellt. Der Rest der Nanopartikelsuspension in der Monomerlösung wurde im Kühlbad bei −18 °C unter ständigem Mischen vorgekühlt, bis sich Eiskristalle bildeten. 10 ml vorgefrorene Suspension wurden in das Glasröhrchen gegeben und 0,007 g APS wurden hinzugefügt. Die Suspension wurde gemischt und bei –18 °C vollständig gefrieren gelassen. Die gefrorenen Proben wurden 20 Stunden lang bei –18 °C aufbewahrt und dann bei Raumtemperatur aufgetaut. Das Eisenoxid-Kryogel von 140 ml wurde auf ähnliche Weise hergestellt. Die Reaktionslösung (150 ml Monomerlösung plus 15 g α-Fe2O3) wurde im Kühlbad bei −18 °C unter ständigem Mischen vorgekühlt, bis sich Eiskristalle bildeten. Die Reaktionssuspension wurde in eine 150-ml-Spritze gegeben und mit Initiator versetzt. Die Proben konnten über Nacht bei –18 °C einfrieren. Am nächsten Tag wurde die Probe aufgetaut und mit Wasser gewaschen. Aktivkohlekügelchen-Acrylamid-Verbundwerkstoffe wurden auf ähnliche Weise hergestellt, indem zu 100 ml einer AAm- und MBAA-Lösung Kohlenstoffkügelchen (MAST Carbon International Ltd, S-250/500-TE9/16–20 °C) hinzugefügt wurden, die über Nacht in Wasser vorbenetzt waren (3,3 g Zoll). 15 ml Wasser). Zur Herstellung von Kohlenstoffnanoröhren-Verbundwerkstoffen wurden 6 ml Kohlenstoffnanoröhrensuspension (0,09 g Trockengewicht) zu 100 ml AAm-Lösung (4,8 g) und MBAA-Lösung (1,6 g) gegeben. Die Lösung wurde 20 Minuten lang entgast und 0,01 ml TEMED zugegeben. Die Suspension der Nanoröhren in der Monomerlösung wurde im Kühlbad bei −18 °C unter ständigem Mischen vorgekühlt, bis sich Eiskristalle bildeten. Anschließend wurden 0,07 g APS zugegeben. Die Suspension wurde gemischt und bei –18 °C vollständig gefrieren gelassen. Die gefrorene Mischung wurde 20 Stunden lang bei –18 °C gehalten und dann bei Raumtemperatur aufgetaut.

Hydrogelproben wurden durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie mit einem Leica TCS SP5 CLSM unter Verwendung einer normalen 20-fach-Objektivlinse untersucht. Aus dem nassen Gel wurde eine etwa 1 mm dicke Scheibe geschnitten und 20 Stunden lang mit FITC-Lösung (0,02 mg/ml in Natriumphosphatpuffer, pH 9,0) gefärbt. Die Proben wurden mit Puffer und Wasser ausgewaschen, um nicht gebundenes FITC zu entfernen. Die verwendeten Anregungs- und Emissionswellenlängen betrugen 488 bzw. 530 nm. Bilder wurden durch optische Schnitte in den xy-Ebenen entlang der z-Achse mit 50 optischen Schnitten in Abständen von 1 μm erzeugt. Zur Bestimmung der Porengröße von Hydrogelen wurde die Software ImageJ verwendet. Für die Rasterelektronenmikroskopie wurde ein 400 ml pHEMA-Gel geschnitten, wie in Abb. 3(e) gezeigt, und fünf Proben wurden für die Bildgebung entnommen. Die Proben wurden durch Gefriertrocknung der Gele über Nacht hergestellt. Nach dem Trocknen wurden die Proben auf Aluminiumstummeln montiert, die mit selbstklebenden Kohlenstoffpolstern versehen waren, mit Platin durch Sputtern beschichtet und mit einem Zeiss NTS Sigma FEG Rasterelektronenmikroskop untersucht. Die in Abb. 4 gezeigten Kryogele wurden auf die gleiche Weise hergestellt und analysiert. Die Nieder- und Hochdruck-Quecksilberintrusionsmessungen und die Datenanalyse wurden mit der Software Quantachrome Instruments, USA und PoreWin 6.0 durchgeführt. Temperaturprofile wurden gemessen, indem 6 Thermoelemente an verschiedenen Positionen in die Reagenzlösung eingetaucht wurden. Die Temperatur in der Reaktionslösung während der Gelherstellung wurde mit einem USB-Thermoelement-Datenlogger TC-08 (Pico Technology) und der Easy Temperature-Software aufgezeichnet. Die mechanischen Eigenschaften des Gels wurden mit einem TA.XTplus Texture Analyzer (Stable Micro Systems) getestet. Die Gele wurden durch Abschneiden von Zylindern mit 9 mm Durchmesser aus den verschiedenen Teilen des Gels hergestellt. Es wurde eine maximale Belastung von 5 N angewendet. Der Kompressionsmodul bei einer Dehnung von 0,1 wurde mit der Software TA.XTplus berechnet. Der Eisengehalt in den zusammengesetzten Kryogelen wurde gemäß21 untersucht. Der Eisengehalt wurde durch Extraktion von Eisen mit 2 M HCl gemessen. Die Eisenkonzentration in der Lösung wurde mit einem Perkin Elmer OptimaTM 2100 DV ICP-OES-System gemessen.

Die As(III)-Lösung wurde gemäß der in21 beschriebenen Methode hergestellt. Die As(III)-Lösung, 10 mg/L, pH 7,0, wurde durch ein 4 ml oder 140 ml AAm-α-Fe2O3-Komposit gepumpt. Eine Fraktion von 10 ml wurde gesammelt. Die Konzentration von As(III) wurde mit einem Perkin Elmer OptimaTM 2100 DV ICP-OES-System gemessen.

Zitierweise für diesen Artikel: Savina, IN et al. Eine einfache Methode zur Herstellung großvolumiger 3D-makroporöser Hydrogele für fortschrittliche biotechnologische, medizinische und ökologische Anwendungen. Wissenschaft. Rep. 6, 21154; doi: 10.1038/srep21154 (2016).

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Diese Arbeit wurde durch FP7-Projekte finanziell unterstützt: PERG08-GA-2010-276954 (BioSmart), PEOPLE-2013-IAPP-612250 (WasClean) und PEOPLE-2011-IAPP-286089 (OncoNanoBBB). Die Autoren danken Protista Biotechnology AB (www.protista.se) für den Zugang zu Materialien und Technologien mit monolithischer poröser Polymerstruktur (MPPS®).

School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, University of Brighton, Huxley Building, Lewes Road, BN2 4GJ, Brighton, Großbritannien

Irina N. Savina, Ganesh C. Ingavle und Sergey V. Mikhalovsky

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Andrew B. Cundy

Fakultät für Ingenieurwissenschaften, Nasarbajew-Universität, 010000, Astana, Kasachstan

Sergej V. Michalowski

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ISand SM hat die ursprüngliche Forschung entworfen. IS und GI führten die Synthese und Charakterisierung durch, analysierten die Daten und verfassten das Manuskript. IS, GI, SM und AC diskutierten die Ergebnisse und ihre Anwendungen/Auswirkungen und kommentierten das Manuskript. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Savina, I., Ingavle, G., Cundy, A. et al. Eine einfache Methode zur Herstellung großvolumiger 3D-makroporöser Hydrogele für fortschrittliche biotechnologische, medizinische und ökologische Anwendungen. Sci Rep 6, 21154 (2016). https://doi.org/10.1038/srep21154

Zitat herunterladen

Eingegangen: 14. Juni 2015

Angenommen: 18. Januar 2016

Veröffentlicht: 17. Februar 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep21154

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